他巴唑对甲状腺滤泡细胞凋亡的影响

石　英　周秀文　李　浩　黄国良

1　福建省漳州市新浦医院　363000；　2　福建医科大学附属漳州市医院；　3　福建省协和医院内分泌科



他巴唑对甲状腺滤泡细胞凋亡的影响

石英1周秀文2李浩2黄国良3

1福建省漳州市新浦医院363000；2福建医科大学附属漳州市医院；3福建省协和医院内分泌科

他巴唑是抗甲状腺药物，属于咪唑类化合物，适用于各种典型的甲状腺亢进症。经研究证明，基于甲状腺滤泡上皮细胞的过度增生和肥大的原因而形成的甲状腺肿伴随着功能的格雷福斯病(GD)，是由于病理改变等原因，使得甲状腺滤泡上皮细胞持续增生和自然凋亡减缓所造成的[1]。因此，对抗甲状腺滤泡细胞的非正常增生和凋亡是治疗甲状腺功能亢进的重要途径和方法。

1资料与方法

1.1临床资料实验所需的甲状腺组织是屠宰场猪甲状腺组织，把提取的10块新鲜组织迅速进行组织分离和酶消化，然后送实验室培养。所用试剂有胎牛血清、RPMI1640培养粉、磷酸盐缓冲液(PBS)干粉、胶原酶、甲状腺球蛋白克隆抗体等。所用医疗器械都是实验室标准器械，符合医疗实验标准。比如细胞培养板、超净工作台、倒置相差显微镜、双重纯水蒸馏器、FACScan型流式细胞仪、电泳仪(DYY-3 IC型)等。

1.2方法

1.2.1主要试剂的配置:上述实验材料和实验器械主要是为试剂的合成做更深一步的准备，比如用RPMI1640培养粉加碳酸氢钠在pH值为7.2的情况下过滤、储存、培养后加入青霉素、链霉素和胎牛血清等调和成RPMI1640培养液，为培养做准备；然后加入一定比例的胎牛血清，让RPMI1640培养液中含胎牛血清10%;然后用KCl、NaCl、酚红、去离子水等材料配置成D-Hanks液(HBSS)，然后低温储存备用；然后用磷酸盐缓冲液(PBS)干粉加去离子水配置成磷酸盐缓冲液(PBS)；然后用胰蛋白酶加入磷酸盐缓冲液(PBS)制成0.25%胰蛋白制剂备用；最后甲醇中放入Giesma(萨姆粉)加入甘油和磷酸盐缓冲液(PBS)混合制成Giesma染色液[2]。

1.2.2培养和鉴别甲状腺滤泡细胞(TFC):把取来的甲状腺组织剪成小块，一般是1~3mm，然后用以上准备的D-Hanks液(HBSS)漂洗，此时应注意去除其中的结缔组织，同时漂洗时要充分洗去红细胞等物质，以免影响实验效果。然后在37℃的二型胶原酶的消化液中进行消化，30min收集1次细胞，一般收集4~5次即可。然后再把收集的离心过的细胞用D-Hanks液(HBSS)冲洗2~3次，最后将其放入含FSC的RPMI1640培养液中，提前准备好的恒温箱内进行37℃培养4~5d，为了细胞很好的生长平均1~2d换1次培养液。甲状腺滤泡细胞的检测用SABC免疫组化试剂盒进行，一般是涂片后用丙酮固定，然后磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，大致3次，3min/次。清除氧化物酶后封闭PBS冲洗1次[3]。加入克隆抗体后再进行冲洗，此时再加入链霉卵白素，在37℃的情况下30min，再次PBS冲洗，最后用苏木素复染即可。

2结果

2.1用Giesma染色后观察甲状腺滤泡细胞凋亡的影响。他巴唑的浓度依次设定为1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2，然后观察可见，随着浓度的增加，甲状腺滤泡细胞的形态也在改变，详见表1。

表1　他巴唑的浓度对甲状腺滤泡细胞凋亡的影响(mol/L)

2.2同时对同种浓度的他巴唑分别在24h、48h、72h对甲状腺滤泡细胞凋亡的情况进行观察，发现其对甲状腺滤泡细胞的凋亡也有影响，详见表2。

表2　不同时间他巴唑对甲状腺滤泡细胞凋亡的影响

2.3把他巴唑与结构相似的药物比如：咪唑、硫脲进行对比试验，发现咪唑、硫脲这类结构类似药物对甲状腺滤泡细胞凋亡情况的影响也有不同，详见表3。

表3　他巴唑与类似结构药物对甲状腺滤泡细胞凋亡的影响

3讨论

众所周知的，细胞凋亡是细胞的程序性死亡，并且不带炎症等病理变化，是机体自我更新的必要形式。他巴唑自发现以来就是效果较好的抗甲亢药物，实验发现，他巴唑是通过抑制甲状腺滤泡细胞的氧化酶系统来抑制碘化的[4]。患者在长期给药的过程中，依附性较好，所以才得到广泛的使用。甲状腺功能亢进是由于甲状腺滤泡细胞凋亡受到了某种抑制效果，使得甲状腺滤泡细胞长期不断地分化增生，从而患者的甲状腺在功能和形态上发生了病理性变化。而在以上结果中笔者发现，当他巴唑的浓度为1×10-6时，对甲状腺滤泡细胞几乎没有诱导其消亡的作用，但随着浓度的改变，到1×10-3时，他巴唑对甲状腺滤泡细胞诱导其消亡的作用最明显。由此可见，他巴唑对甲状腺滤泡细胞凋亡的影响是浓度越高，诱导其消亡的比率就越大，形态功能的变化越大；在不同时间的情况下，他巴唑对甲状腺滤泡细胞的影响是时间越久对诱导甲状腺滤泡细胞消亡的影响就越大，大致成正相关的关系；他巴唑中不仅含有硫脲基，还含有咪唑环。通过表3可以看出，咪唑对甲状腺滤泡细胞的凋亡也有诱导作用。可以得出，他巴唑诱导甲状腺滤泡细胞的凋亡不一定只是通过硫脲基，它还能通过现在未知的途径对甲状腺滤泡细胞的凋亡进行诱导。

从以上实验对比可以看出，他巴唑对甲状腺滤泡细胞的凋亡具有很好的诱导作用，浓度在1×10-3时效果最好，而时间则是72h内，诱导凋亡的作用随着时间的增长呈正相关的关系。同时经过类似结构的药物对比发现，他巴唑主要是通过硫脲基团的作用而对甲状腺滤泡细胞的凋亡起诱导作用。

参考文献

[1]何珂,胡蕴,毛晓明.淋巴细胞对人原代甲状腺滤泡上皮细胞凋亡的影响〔J〕.免疫学杂志,2014,11(1):421-422.

[2]马文竹.中医药对甲亢细胞凋亡影响的研究进展〔J〕.光明中医,2014,6(20):63-64.

[3]连丽新.自噬对甲状腺滤泡癌放化疗增敏作用的研究〔D〕.长春：吉林大学,2014.

[4]刘纯,张徽,等.凋亡相关蛋白Fas/FasL和BcL-2在自身免疫性甲状腺病中的表达及意义〔J〕.内分泌外科,2002,1(1): 9-11.

(本文通讯作者：黄国良)

(编辑羽飞)

摘要目的：对他巴唑对甲状腺滤泡细胞的影响进行深入探讨和剖析，并对其作用的构效关系进行研究，以供相关工作人员借鉴。方法：用不同浓度的他巴唑对培养过的甲状腺滤泡细胞(TFC)在不同作用时间进行比较，另外，用类似结构的药物，比如硫脲、咪唑处理甲状腺滤泡细胞,应用Annexin-V FITC/PI双标染流式细胞仪对甲状腺滤泡细胞凋亡率进行检测，对比研究他巴唑对甲状腺滤泡细胞凋亡的影响。结果：不同剂量的他巴唑对甲状腺滤泡细胞凋亡的诱导有依赖性，甲状腺滤泡细胞数量的明显增多就是证明。类似药物中的硫脲对甲状腺滤泡细胞有相似的效果，但是咪唑对甲状腺滤泡细胞没有相关的效果。结论：他巴唑增多甲状腺滤泡细胞的数量比率，主要是依赖硫脲基因产生诱导凋亡作用的。

关键词他巴唑甲状腺滤泡细胞凋亡研究影响 R9

文献标识码：A

文章编号：1001-7585(2015)15-1973-02

Tapazole Influence on Thyroid Follicular Cell Apoptosis

SHI Ying*，ZHOU Xiuwen，LI Hao，et al.*ZhangzhouSinpoHospital,ZhangzhouCity,FujianProvince363000

ABSTRACTObjective: Discuss and analyze the influences of tapazole on thyroid follicular cells (TFC) and study the structure-activity relationship of the influences,so as to provide a certain reference to the related personnel. Methods: Compare TFC cultured with tapazole of varied concentration at different time,treat TFC with drugs of the similar structure,including thiourea,imidazole,test the TFC apoptosis rate with the Annexin-V FITC/PI Dou S-P flow cytometer,and make a comparative research on the influences of tapazole on the TFC apotosis. Results: Tapazole of different dosages has induction and dependence on the TFC apotosis,which is justified by obvious increase of TFC. Thiourea in similar drugs has the similar effect on TFC,but imidazole has not the related effect on TFC. Conclusion: Topazole produces apoptosis effect of induced thyroid filtration cell by increasing the mumber rate of the thyroid filtration cells,aiming at the thioureido group.

KEY WORDSTapazole,Thyroid follicular cell apoptosis,The impact

收稿日期2015-04-10