隐球菌性脑膜炎脑脊液四种检测方法的比较

李文华　刘增香　罗金凤

中山大学附属第五医院　1检验科　2儿科　3 设备科，广东省珠海市　519000



(编辑紫苏)

隐球菌性脑膜炎脑脊液四种检测方法的比较

李文华1刘增香2罗金凤3

中山大学附属第五医院1检验科2儿科3 设备科，广东省珠海市519000

新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)是存在于自然界土壤和鸽子等鸟类粪便中的一种真菌，它可以经呼吸道进入人体后产生一种胞外酶脂酶B，破坏肺泡中的表面活性物质，在肺内形成病灶，数月后经血行播散到脑或脑膜，引起新型隐球菌性脑膜炎(Cryptococcus meningitis,CM)。近年来随着环境污染的增加，机体免疫缺陷患者大量增加，大量激素和抗生素的不合理使用，使CM发病呈逐年上升趋势，全球每年约有957 900人患CM[1]。由于CM临床表现比较复杂，症状不典型，很容易在发病早期出现误诊或漏诊，根据2010年美国感染病学会最新的隐球菌病临床指南，如能早期诊断、合理治疗，大部分患者是可以治愈的[2,3]。由此可见，对脑脊液中隐球菌的尽早发现尤为重要，现就临床上常用的四种检测方法进行比较分析,报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料选取2011年1月—2014年12月我院收治的脑脊液隐球菌PCR阳性患者104例，其中只有98例通过墨汁染色法或真菌培养法找到隐球菌，其中男62例，女36例，年龄3～77岁，平均年龄(43±5.9)岁。

1.2仪器和试剂仪器：培养采用德国Hera公司生产CO2培养箱，奥林巴斯CX21显微镜，北京白洋医疗器械厂生产的BY320型离心机。试剂：印度墨汁，新型隐球菌乳胶凝集试剂由美国IMMY公司生产，沙保罗培养基干粉从杭州生物公司购得，真菌鉴定用法国公司API20Aux试剂，PCR试剂由上海重工生化工程公司提供。

1.3方法

1.3.1脑脊液涂片墨汁染色：取脑脊液3ml左右，400g/min离心15min，弃上清液，取沉淀物一小滴涂片，再取印度墨汁一小滴，混合后加盖玻片，先用低镜观察，发现黑色中有圆形透明可疑小点再转成高镜确认，镜下可见细胞，是圆形双层结构，壁厚，透明荚膜包裹着菌细胞，菌体大小可不一，即为隐球菌墨汁染色阳性。

1.3.2真菌培养法：取脑脊液50μl直接涂抹于沙氏培养基上，放于35℃的CO2培养箱培养48~72h，在沙保罗上挑取圆形、光滑、奶油样白色菌落2~3个进行，用API20Aux做鉴定，根据鉴定为新型隐球菌。

1.3.3乳胶凝集法：取脑脊液3ml在100℃水中水浴5min冷却备用，取25μl原液与25μl乳液试剂混合3min看结果，判断标准同说明书，阴性结果和阳性结果必须达到要求方能报告。

1.3.4PCR扩增法：取新鲜脑脊液200μl,7 000g/min离心5min后弃去上清液，在剩余的沉淀物中加碱性裂解液0.5ml，98℃10min后,再予7 000g/min离心5min后，取上清液做试验模板，然后按照试剂操作说明书加入缓冲液、引物、模板及Tag DNA聚合酶,用无菌石蜡油覆盖，进入到PCR循环，循环为95℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，32个循环，最后72℃延伸5min，PCR扩增产物用2g/L琼脂糖凝液电泳，100V 30min，在紫外线灯下观察结果，出现特异性条带为隐球菌阳性。

2结果

按照新型隐球菌脑膜炎诊断标准，结合临床症状、体征、脑脊液常规及生化检查异常等情况，脑脊液新型隐球菌PCR结果为阳性的104例中，通过脑脊液涂片墨汁染色或者真菌培养法找到新型隐球菌共98例，即临床确诊的隐球菌感染为98例，四种方法的检测时间和阳性率见表1；四种方法的符合率见表2；四种方法符合例数的卡方比较见表3。

表1　四种方法的阳性统计指标

表2　四种方法的符合率比较(n)

表3　四种方法符合例数的卡方比较

注：*P<0.05,差异有统计学意义。

3讨论

墨汁染色法是各实验室最简单、方便且易开展的方法，由表1、表2可以看出,墨汁染色法与其他三种方法相比，它的阳性率和符合率最低，一方面，在发病早期隐球菌数量较少；另一方面，隐球菌主要集中在脑膜或脑室脉络丛肉芽肿细胞内，穿刺部位对检出率会有影响。如果穿刺脑脊液时混入血细胞，也会影响隐球菌的检出率。而且随着病程进展，大量抗真菌药物的使用，使治疗后的隐球菌出现退形变，有透明的荚膜，在高倍镜下不易看清或难以辨认。本次统计直接涂片墨汁染色法阳性率和符合率分别是75.00%和79.59%，仍有20.41%(20/98)未检出，与文献[4]报道80%阳性率一致，故本方法不利于早期诊断。真菌培养法一直是诊断隐球菌感染的金标准，本方法特异性高，一旦查出就可确诊，但其敏感性并没有PCR方法高。本次统计中仍有6例涂片可见隐球菌但培养阴性，可能与菌量少难以在平板上形成菌落有关，与接种量较少也有一定关系；同时也可能因大剂量使用抗真菌药物，使脑脊液标本因药物作用抑制了隐球菌的生长，使培养呈现假阴性结果；真菌培养法的培养时间是四种方法中最长的，平均需要73h，是四种方法中最慢出报告的，因此也不利于CM的早期诊断。乳胶凝集法的阳性率和符合率分别为91.35%和96.94%，与文献报道[5]90.9%的阳性率相一致，可作为早期诊断隐球菌感染非常好的方法。由于本次的病例符合CM诊断特征(临床病状、体征、脑脊液常规生化检查异常)，且PCR方法为隐球菌阳性的病例，并未统计乳胶凝集法中非隐球菌感染患者的假阳性问题，这方面统计有待研究。有文献报道，脑脊液做适当稀释可以避免乳胶凝集法假阳性的产生[6]。另外，风湿因子存在也可出现假阳性结果；在隐球菌感染早期，或者高滴度的前带影响等情况下，乳胶凝集法会出现假阴性结果[7]。PCR方法检测脑脊液隐球菌的阳性率和符合率分别是100.00%和94.23%，在四种方法中阳性率最高，符合率仅次于乳胶凝集法，而且检测时间短，操作快速简便[8]。此次统计中，PCR方法阳性共104例，但临床确诊只有98例，即6例存在假阳性，假阳性率为5.77%，尽管如此，它在早期诊断方面仍然具有非常大的优势。

从表3可以看出，真菌培养法、乳胶凝集法、PCR法分别与墨汁染色法的符合率相比较，均有显著性差异(P<0.05)，说明这三种方法的符合率明显高于传统的墨汁染色法。符合率较高的PCR方法与乳胶凝集法相比较，符合率差异没有统计学意义(P>0.05)，说明这两种方法的符合率差异不大。

由此可见，墨汁染色法阳性率和符合率低，不适合早期诊断；真菌培养法特异性好，一直是诊断的“金标准”，但敏感性有限，报告时间也长；抗原乳胶凝集法的特异性和敏感性高，但容易出现假阳性；PCR法特异性、敏感性高，但也有5.77%的假阳性。在CM早期，乳胶凝集法和PCR法作为诊断隐球菌性脑膜炎有无可替代的优势，为患者赢得治疗时间，同时结合培养法进一步确诊；在治疗中可以选择乳胶凝集法、墨汁染色法来观察隐球菌多少来初步判定药物治疗的疗效；在治疗数月和恢复期，也可以结合乳胶凝集法、PCR、真菌培养法和墨汁染色法来评价患者恢复状况，总之，四种方法各有优缺点，互相补充，为临床更好地发现和治疗CM发挥重要的作用。

参考文献

[1]Park BJ,Wannemuehler KA,Marston BJ,etal. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS 〔J〕.AIDS,2009,23(4):525.

[2]Saha DC,Xess I,Biswas A,etal. Detection of Cryptococcus by conventional,Serological and molecular methods 〔J〕. Med Microbiol,2009,58(8):1098-1105.

[3]Perfect JR,Dismukes WE,Dromer F,etal. Clinical Practice guidelines for the management of cryptococcal disease :2010 up-date by the infection disease society of America〔J〕. Clin Infect Dis,2010,50(3):391-322.

[4]李京红，张国俊. 新型隐球菌脑膜炎脑脊液的检测方法探讨〔J〕.中国实用神经疾病杂志,2009,8(11):85-87.

[5]何艳群,田敬华,华文浩，等. 53例艾滋病合并隐球菌性脑膜炎脑脊液检测分析〔J〕.北京医学,2012,34(6):459-461.

[6]王欣，张伦理，郭彦,等.新型隐球菌检测方法的比较及临床应用〔J〕.中国卫生检验杂志， 2013,23(5)：1180-1182.

[7]班立芳，孔庆飞，王勇鸣,等.新生隐球菌性脑膜炎的脑脊液标本检验方法分析〔J〕.中国医药科学,2012,2(8):83-84.

[8]韩慧，胡子有，吴炳义,等.荧光定量PCR和环介导等温扩增方法检测隐球菌CAP10基因的比较研究〔J〕.南方医科大学学报,2012,32(6):817-820.

(编辑落落)

摘要目的：比较隐球菌性脑膜炎患者脑脊液中检测隐球菌四种方法的优缺点。方法：分别采用墨汁染色法、真菌培养法、隐球菌抗原乳胶凝集法、聚合酶链反应法(PCR)检测脑脊液中的新型隐球菌属。结果:墨汁染色法、真菌培养法、乳胶凝集法、PCR法四种方法的阳性率和符合率分别是75.00%与79.59%、84.62%与89.80%、91.35%与96.94%、100.00%与94.23%；墨汁染色法阳性率和符合率低，不适合早期诊断；真菌培养法特异性好，但敏感性低，报告时间长；乳胶凝集法的特异性和敏感性高，但容易出现假阳性；PCR法特异性、敏感性高，但也有5.77%的假阳性。真菌培养法、乳胶凝集法、PCR法的符合率明显高于墨汁染色法。结论:四种方法各有优缺点，应根据临床病程灵活选择。

关键词隐球菌性脑膜炎脑脊液检测方法 R446

文献标识码：A

文章编号：1001-7585(2015)15-1971-03

Comparison of Four Methods for Detection of Cryptococcal Meningitis Cerebrospinal Fluid

LI Wenhua*，LIU Zengxiang， LUO Jinfeng.*DepartmentofLaboratory，theFifthHospitalAffiliatedtoZhongshanUniversity，ZhuhaiCity，GuangdongProvince519000

ABSTRACTObjective：To compare the detection of Cryptococcus in cerebrospinal fluid in the patients with Cryptococcus meningitis and the advantages and disadvantages of the four methods. Methods：Use the ink staining method,fungi culture method,Cryptococcus antigen latex agglutination method and the method of polymerase chain reaction (PCR) to detect Cryptococcus neoformans in CSF. Results：Ink staining method and fungi culture method,latex agglutination method,PCR method,four methods of positive rate and the coincidence rate is 75.00% and 79.59%, 84.62% and 89.80%,91.35% and 96.94%， 100.00% and 94.23% respectively. Ink staining positive rate and the coincidence rate is low,not suitable for early diagnosis; fungi culture method specificity,but low sensitivity,and use a long time to report. Antigen latex agglutination method,high specificity and sensitivity,but easy to produce false positive results; PCR method specificity,high sensitivity,5.77% false positive .The coincidence rate of culture method and latex agglutination method and PCR method was significantly higher than that of the ink staining method. Conclusion：The four methods have their advantages and disadvantages,and we should choose them according to the clinical course need.

KEY WORDSCryptococcus meningitis,Cerebrospinal fluid,Detection method

收稿日期2015-03-29