外周血CD4+CD25+CD127low调节性T细胞在恶性肿瘤患者免疫功能评估中的作用

姜艳丽,刘　磊,王雪野*,刘龑航

(1.吉林省人民医院 肿瘤科;2.吉林省人民医院 肿瘤生物治疗中心，吉林 长春130021)



外周血CD4+CD25+CD127low调节性T细胞在恶性肿瘤患者免疫功能评估中的作用

姜艳丽1,刘磊2,王雪野1*,刘龑航1

(1.吉林省人民医院 肿瘤科;2.吉林省人民医院 肿瘤生物治疗中心，吉林 长春130021)

摘要：目的观察恶性肿瘤患者外周血CD4+CD25+CD127low调节性T细胞(CD4+CD25+CD127lowTreg)的数量变化，探讨外周血CD4+CD25+CD127lowTreg检测在恶性肿瘤患者免疫功能评估中的作用。方法以35例正常人作为对照组，采用流式细胞术检测74例肿瘤患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg在CD4+T细胞的比例，分析不同TNM分期恶性肿瘤患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T细胞的百分比，采用实时荧光定量RT-PCR技术检测PBMC转录因子Foxp3表达水平。结果肿瘤患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T细胞百分比为(6.19±1.82)%，明显高于对照组(3.12±1.16)%，差异具有统计学意义(P<0.05)。其中Ⅲ、Ⅳ期患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg百分比分别为(6.08±2.14)%、(6.88±2.65)%，明显高于Ⅰ-Ⅱ期患者(5.65±1.86)%，P<0.05；病理分型为低分化者CD4+CD25+CD127lowTreg百分比为(6.72±2.60)%，明显高于高分化者(5.94±2.11)%，P<0.05；有淋巴结转移者CD4+CD25+CD127lowTreg百分比为(6.95±3.12)%，明显高于无淋巴结转移者(5.02±2.09)%，P<0.05。结论恶性肿瘤患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T细胞的比例明显升高，监测CD4+CD25+CD127lowTreg有利于评估肿瘤患者的免疫功能和辅助判断肿瘤患者的病情进展及预后。

(ChinJLabDiagn,2015,19:1117)

免疫功能的评估对于掌握肿瘤患者的最佳治疗时机和制定合理的诊疗方案，评价治疗的效果均具有重要意义。T细胞介导的细胞免疫功能是机体抗肿瘤免疫的主要方式，外周血中CD4和CD8两类T细胞亚群的相互制约维系着机体免疫系统的平衡。研究发现，肿瘤患者常表现为T细胞亚群比例失调，免疫抑制因子的升高和或免疫促进分子表达水平的降低[1,2]。我们观察发现，CD4+CD25+Treg细胞在肿瘤患者中比例显著增加，CD4+CD25+Treg细胞比例的下调有助于提供机体的抗肿瘤效应和利于肿瘤的治疗效果[3]。Foxp3被认为CD4+CD25+Treg细胞的重要标记物，因其在细胞内表达，因而需要对细胞固定和穿孔后才能坚定，降低其的临床实用性。CD127的表达与Foxp3成负相关，被证实可以替代Foxp3成为Treg细胞的特异性标志物。本研究采用流式细胞仪分析恶性肿瘤患者CD4+CD25+CD127lowTreg表达情况，探讨其在肿瘤临床诊疗和免疫评估的重要意义。

1材料和方法

1.1临床资料实验组为本院2012年3月-2014年4月门诊或住院的74例恶性肿瘤患者，男43例， 女31例，年龄20 -81岁，中位年龄52岁，所有病例均经病理诊断证实，临床分期根据国际抗癌协会标准，其中肺癌15例，原发性肝癌19例,胃癌16例，结直肠肿瘤12例,乳腺癌7例，卵巢癌5例。其中Ⅰ-Ⅱ期42例、Ⅲ期17例、Ⅳ期15例；所有患者未经过抗肿瘤化疗及免疫治疗。对照组35例，为本院体检的健康成人，其中男19例，女16例，年龄26-70岁，中位年龄45岁。

1.2主要试剂及仪器鼠抗人单克隆抗体CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE，同型对照IgG1、IgG2、红细胞裂解液、流式细胞仪(EPICS XL)购自美国贝克曼库尔特公司；PCR扩增引物由北京鼎国公司合成， SYBR Green试剂购于广州达安基因公司，ABI Prism 7500荧光定量PCR仪器。

1.3外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例检测所有被观察对象均于清晨空腹采集静脉血2 ml，经EDTA-2K抗凝，使用直接免疫荧光标记法标记细胞并进行流式细胞仪分析。操作步骤：取单克隆抗体CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE及同型对照各20 μl，加入100 μl EDTA-2K抗凝的外周血，室温下避光孵育15 min，再加入红细胞裂解液500 μl，避光孵育10 min；加入PBS洗2次，离心1500转，5 min，弃上清后加入适量的PBS，上机检测。

1.4Foxp3 mRNA的荧光定量PCR检测上游引物为5’-GTGGCATCATCCGACAAGG-3’；下游引物为5’-TGTGGAGGAACTCTGGGAAT-3’。 TRIZOL Reagent提取PBMC总RNA。参照AMV Reverse transcriptase说明方法将总RNA合成cDNA。应用SYBR Green嵌合荧光法进行Real-Time PCR检测，以GADPH作为内参对照，同一cDNA模板均在同一反应条件下行3次重复实验，结果采用2-ΔΔCT的数据统计方法。

2结果

2.1　外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例

流式细胞仪检测分析显示(图1，表1),肿瘤患者治疗前外周血CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T细胞的比率为(6.19±1.82)%，显著高于健康对照组(3.12±1.16)%，差异具有统计学意义(P<0.05)。进一步对数据进行分析显示，Ⅲ、Ⅳ期肿瘤患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg百分比分别为(6.08±2.14)%、(6.88±2.65)%，明显高于Ⅰ-Ⅱ期肿瘤患者(5.65±1.86)%，P<0.05。病理分型为低分化者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例为(6.72±2.60)%，明显高于高分化者(5.94±2.11)%，P<0.05；有淋巴结转移的患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例为(6.95±3.12)%，明显高于无淋巴结转移者(5.02±2.09)%，P<0.05。

图1　外周血CD4+CD25+CD127lowTreg流式分析图

组别nCD4+CD2+CD127low/CD4+T(%)P值正常对照组353.12±1.16P<0.05肿瘤患者746.19±1.82肿瘤分期 Ⅰ-Ⅱ期425.65±1.86P<0.05 Ⅲ期176.08±2.14 Ⅳ期156.88±2.65分化程度 中、高度分化315.94±2.11P<0.05 低分化436.72±2.60淋巴转移 无转移575.02±2.09P<0.05 有转移176.95±3.12

2.2　外周血PBMC中转录因子Foxp3表达变化

肿瘤患者外周血PBMC中转录因子Foxp3表达与正常组相比均显著增高(P<0.05)，其中Ⅳ期肿瘤癌患者组Foxp3增高最明显(P<0.01)，见图2。

图2　PMBC中Foxp3 mRNA的相对表达量

3讨论

研究发现，肿瘤患者常处于免疫功能低下状态，肿瘤发生时常伴有外周血中CD4+CD25+Tergs诱导性增高。CD4+CD25+Tregs可抑制机体的抗肿瘤免疫反应，减弱或抑制疫苗诱导的抗肿瘤免疫作用，参与肿瘤免疫逃逸[4]。我们前期对61例的肿瘤患者评估研究中证实[5]，CD4+CD25+Treg的变化与肿瘤的分期密切相关，是导致肿瘤进展重要的因素。

缺乏理想的特异性标记是限制研究CD4+CD25+Treg检测及分析的最大障碍。CD4+CD25+Treg因为不能包含与活化T细胞重合的那一部分CD4+CD25+Treg，所以不能完全涵盖人体内调节性T细胞[6]。叉头/翼状螺旋转录因子Foxp3是CD4+CD25+Treg在胸腺内发育和功能维持所必需，被认为是CD4+CD25+Treg的理想标记[7]。本研究利用荧光定量PCR技术检测肿瘤患者PBMC中Foxp3的mRNA发现，肿瘤患者PBMC中转录因子Foxp3表达与正常组相比均显著增高(P<0.05)，其中Ⅳ期肿瘤癌患者组Foxp3增高最降明显(P<0.05)，可以作为一种良好的标记物辅助评估CD4+CD25+Treg的比例和肿瘤的免疫功能。但由于Foxp3表达于细胞内，FoxP3标记后的细胞已被破坏，不利于对调节性T细胞做进一步的培养和研究工作[8]。CD127分子被证实在Treg细胞表面呈现低表达并且与Foxp3的表达成负相关，在CD4+CD25+基础上联合CD127抗原可以更好地识别人CD4+CD25+Treg[9]。本研究在对74例恶性肿瘤患者的外周血CD4+CD25+CD127lowTreg含量的分析证实，CD4+CD25+CD127lowTreg可以较好的评估肿瘤患者的机体免疫功能，其在不同类型的肿瘤患者均呈现出较健康人群较高的表达水平，与文献报道结果基本一致[10-12]。同时我们在对肿瘤的不同分期中的检测发现，CD4+CD25+CD127lowTreg表现出差异性表达(P<0.05)，随着肿瘤的进展，机体免疫功能逐渐降低，与我们前期证实的利用CD4+CD25+Treg评估肿瘤的免疫功能呈现出良好的相关性[3]。

综上，CD4+CD25+CD127lowTreg的数量可以作为评价肿瘤的发生发展的重要监测指标。通过分析CD4+CD25+CD127lowTreg可以更好的评估和分析其机体免疫调节中的作用。CD4+CD25+CD127lowTreg同时又可以作为临床上一种靶点，为抗肿瘤免疫提供新的治疗途径。

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关键词：肿瘤；CD4+CD25+CD127low调节性T细胞；流式细胞术

Expression levels of CD4+CD25+CD127lowregulatory T-cell characterize different populations in human peripheral blood with CancerJIANGYan-li1,LIULei2,WANGXue-ye1*.(1.OncologyDepartmentofJilinProvinceHospital；2.TumorbiotherapycenterofJilinProvinceHospital,Changchun130021，China)

Abstract:ObjectiveThis study is assigned to investigate the changes of CD4+CD25+CD127lowTreg in peripheral blood from cancer patients and explore its clinical significance.MethodsThe proportion of CD4+CD25+CD127lowTreg in CD4+T cells in peripheral blood were measured by flow cytometry in 74 tumor patients and 35 cases of normal people as control .Foxp3 expression were determined by quantitative real?time PCR.ResultsThe ratio of CD4+CD25+CD127lowTreg in CD4+T cell of tumor patients (6.19±1.82%) was obviously higher than that in the healthy control group (3.12±1.16%),the difference was statistically significant (P<0.05).Peripheral blood CD4+CD25+CD127lowTreg level is significantly higher ratio in patients with stage Ⅲ (6.08±2.14%) and stage IV(6.88±2.65%) than that in stage Ⅰ-Ⅱ(5.65±1.86%),P<0.05.With pathological classification，CD4+CD25+CD127lowTreg level in the poorly differentiated is higher than that in the high differentiated(6.72±2.60% vs 5.94±2.11,P<0.05).CD4+CD25+CD127lowTreg level in the patients who got lymph node metastasis is higher than that in the patients who didn’t get lymph node metastasis(6.95±3.12% vs 5.02±2.09%，P<0.05).ConclusionThe proportion of CD4+CD25+CD127lowTreg in peripheral blood of tumor patients increased significantly and was related to tumor progression.CD4+CD25+CD127lowTreg would help evaluate the immune function of cancer patients.

Key words:tumor；CD4+CD25+CD127lowTreg；FACS

(收稿日期：2014-08-20)

作者简介：姜艳丽(1978-)，女，医学硕士，主治医师，主要从事肿瘤免疫相关研究。

文献标识码：A

中图分类号：R730

文章编号：1007-4287(2015)07-1117-04

*通讯作者

基金项目：吉林省科技厅自然科学基金(编号：201115201)；吉林省卫生厅项目(编号：2011Z074)