首例同时携带blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因的ST11肺炎克雷伯菌临床株

油丽萍，陈爱文，秦　萍，徐　茶，赵　辉，吴春梅，朱元祺*

(1．青岛大学医学院，山东 青岛266071；2.青岛大学附属医院，山东 青岛266003)



首例同时携带blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因的ST11肺炎克雷伯菌临床株

油丽萍1，陈爱文2，秦萍2，徐茶1，赵辉1，吴春梅1，朱元祺2*

(1．青岛大学医学院，山东 青岛266071；2.青岛大学附属医院，山东 青岛266003)

摘要：目的探讨产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的耐药机制，为医院感染控制提供依据。方法法国VITEK-2 Compact对细菌进行鉴定和药敏试验；改良Hodge试验初筛肺炎克雷伯菌是否产碳青霉烯酶；多重PCR对菌株进行β-内酰胺类耐药基因和16S rRNA甲基化酶基因的检测，测序确认基因型；多位点序列分型和脉冲场凝胶电泳实验进行细菌的同源性分析。结果5株肺炎克雷伯菌多位点序列分型是ST11型，其中4株都同时携带有blaspan、blaspan、blaspan和16S rRNA甲基化酶rmtB基因，另外1株(HD03)肺炎克雷伯菌同时携带blaspan、blaspan、blaspan、blaspan和blaspan基因。脉冲场凝胶电泳显示，除了HD04菌株多一条带外，其余带型5株菌完全一致。结论经检索，肺炎克雷伯菌同时携带blaspan、blaspan、blaspan、blaspan和blaspan基因为国内外首次报道，且该感染者无国外流行病学史。因此，要进一步加强对碳青霉烯类耐药的肠杆菌的医院感染控制和预防。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0744)

碳青霉烯类抗生素被认为是目前临床上治疗革兰氏阴性菌感染的最后的一道防线。随着这类抗菌素使用的增加，临床上对碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)的分离率也不断上升。在国内外，由产KPC酶和/或金属酶的肠杆菌科细菌造成的感染，甚至暴发流行，也均有报道[1-3]。尤其是产NDM-1金属酶的“超级细菌”的出现，对临床治疗，控制医院感染的流行和爆发，都将面临更严峻的挑战。因此，本研究是对2013年1-12月收集的碳青霉烯类耐药的5株肺炎克雷伯菌临床株的耐药表型、耐药基因和同源性进行检测分析，以便为医院感染控制提供依据，现报道如下。

1材料与方法

1.1菌株的来源5株菌为2013年1月至2013年12月从临床标本中筛选出的对碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌。采用VITEK-2 Compact全自动微生物分析系统对细菌进行鉴定和药敏，判定耐药性标准依据CLSI2013(美国临床实验室标准化研究所制定)进行，并以Escherichia coli ATCC25922，Escherichia coli ATCC35218和 Klebsiella pneumoniae ATCC700603作为质控菌株。

1.2仪器和试剂法国VITEK-2 Compact全自动微生物分析系统；北京天根生化科技有限公司的离心柱型，基因组提取试剂盒和电泳级琼脂糖；大连宝生的PCR试剂盒和核酸分子量标准；英国Oxoid公司的Mueller-Hinton培养基、美国Bio-Rad的PCR扩增仪和脉冲场电泳，以及全自动凝胶成像系统(Alpha Innotech)。

1.3耐药基因的检测按试剂盒说明书操作进行基因组提取。耐药基因的PCR扩增：(1)金属酶和非金属酶耐药基因：KPC、BIC、OXA48、NDM、IMP、VIM、SPM、AIM、GIM、SIM、DIM)；(2)超广谱β-内酰胺酶基因：SHV、TEM、OXA1、CTX-M分群；(3)AmpC基因：MOX、CIT、DHA、ACC、EBC；(4)16S rRNA甲基化酶基因。扩增目的基因的引物及实验条件参照文献[4-8]进行。引物合成，阳性扩增产物测序，均由上海生工公司完成。获得序列与GenBank中序列进行比对，以确定基因型。

1.4多位点序列分型((multilocus sequence typing，MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)依据MLST网站，设计7对管家基因的引物，PCR条件见网站。扩增产物送上海生工进行测序，序列结果在MLST网站上进行比对，以得到细菌的一个序列型。脉冲场凝胶电泳进行同源性分析的操作参照相关文献。电泳条件：设片段为10-400 kb，场强6 v，转角120，电泳时间18 h。

2结果

2.1　菌株对常用抗生素的耐药性和耐药基因的检测

分离的5株肺炎克雷伯菌对临床常用的抗生素都耐药，改良Hodge试验也均为阳性。基因检测显示：5株菌中4株都同时携带有blaKPC-2、blaTEM-1、blaCTXG9和16S rRNA甲基化酶rmtB基因，另外1株(HD03)肺炎克雷伯菌同时携带blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因。结果详见表1和图1。

表1　产碳青霉烯酶肺炎克雷白杆菌分离株对常用抗生素耐药性和携带的基因

M：DNA标准分子量；1-5：HD01-05株blaKPC阳性；3：HD03株blaNDM阳性

图1blaKPC和blaNDM基因多重PCR扩增产物电泳图

2.2　菌株的同源性分析

5株肺炎克雷伯菌多位点序列分型都是ST11型。脉冲场凝胶电泳显示，除了HD04菌株多一条带外，5株菌其余带型几乎完全一致。结果详见图2。

M：DNA标准分子量；1-5：HD01-HD05肺炎克雷伯菌临床分离株

3讨论

自2001年美国报道KPC酶后，世界各地均见报道，其中美国和希腊有显著的地方性流行。2007年，Wei等首次报道[9]在国内浙江地区发现了产KPC-2酶的肺炎克雷伯菌，此后在全国各地陆续报道检出KPC-2阳性菌株。2009年，印度首次报道发现产NDM-1酶的肺炎克雷伯菌。此后，世界多个国家和地区报道分离到产NDM-1酶的细菌。该酶可水解包括碳青霉烯类在内的几乎所有广谱β内酰胺类抗生素，并可同时携带多种其他耐药基因，给临床治疗和医院感染控制带来巨大挑战。国内感染携带产NDM-1酶基因细菌的病例数逐年增多，多为肠杆菌科细菌，且多属散发，在浙江杭州、北京、上海、兰州、江西和广州等地均有报道。

多位点序列分型(sequence type，ST)是常用的分子流行病学研究方法。巴士德研究院2005年命名的ST11与2008年命名的ST258只有一个管家基因(tonB)的差别，属于同一个克隆复合体CC258，两者有比较近的亲缘关系。研究表明，ST258型是欧美国家肺炎克雷伯菌KPC的主要流行株，中国则以ST11型为主。我们的结果表明，5株肺炎克雷伯菌都是ST11型，与国内报道关于肺炎克雷白杆菌携带blaKPC-2基因的ST分型结果相似。但是，对于产NDM-1酶的肺炎克雷伯菌，国内外还没有主要的ST型流行株的相关报道。

分离的5株菌改良Hodge试验均为阳性，且对常用的抗生素都耐药。基因检测显示， 4株都同时携带有blaKPC-2、blaTEM-1、blaCTXG9和rmtB基因，但另外1株(HD03)肺炎克雷伯菌同时携带blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因。经检索，肺炎克雷伯菌同时携带blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因是国内外首次报道。对该菌携带质粒的数目、大小、接合和转移实验以及基因周围环境的分析正在进行。另外，脉冲场凝胶电泳显示，除HD04菌株多一条带外，5株菌其余带型完全一致，根据Tenover制定的规则，提示医院存在携带blaKPC-2肺炎克雷伯菌克隆株的流行。

综上所述，本地肺炎克雷伯菌临床株对碳青霉烯类抗生素的耐药与其携带ESBLs基因、AmpC基因、碳青霉烯酶基因、以及其他耐药基因的同时存在有关。提示我们，要加强耐药菌的监测，采取消毒隔离措施，防止CRE在医院的扩散和传播。

参考文献：

[1]Centers for Disease Control and Prevention (CDC).Notes from the field: hospital outbreak of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae producing New Delhi metallo-beta-lactamase-Denver,Colorado,2012[J].Morb Mortal Wkly Rep,2013,62(6):108.

[2]李静,胡志东.产碳青酶烯酶肺炎克雷伯菌的检测与分析[J].中华医院感染学杂志,2010,20(15):2324.

[3]Zhao JY,Zhu,YQ,Li YN,et al.Coexistence of SFO-1 and NDM-1 β-lactamase genes and fosfomycin resistance gene fosA3 in an Escherichia coli clinical isolate [J].FEMS Microbiology Letters,2015,362:1.

[4]Poirel L,Walsh TR,Cuvillier V,et al.Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2011,70:119.

[5]Woodford N,Fagan EJ,Ellington MJ.Multiplex PCR for rapid detection of genes encoding CTX-M extended-spectrum β-lactamases[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy ,2005,57:154.

[6]Colom K,Pérez J,Alonso R,et al.Simple and reliable multiplex PCR assay for detection ofblaTEM,blaSHVandblaOXA-1inEnterobacteriaceae[J].FEMS Microbiol Lett,2003,223:147.

[7]Pérez-Pérez FJ,Hanson ND.Detection of plasmid-mediated AmpC β-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR[J].J Clin Microbiol,2002,40:2153.

[8]Berçot B,Poirel L,Nordmann P.Updated multiplex polymerase chain reaction for detection of 16S rRNA methylases:high prevalence among NDM-1 producers[J].Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,2011,71:442.

[9]Wei ZQ,Du XX,Yu YS.Plasmid-mediated KPC-2 in a Klebsiella pneumonia isolate from china[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51(2):763.

关键词：肺炎克雷伯菌；基因；blaNDM-1；blaKPC-2；ST11

Coexistence ofblaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1andblaOXA-1genes in a clinical ST11Klebsiellapneumoniaeisolate in chinaYOULi-ping,CHENAi-wen,QINPing,etal.(TheMedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao266071,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the molecular mechanism of the clinical carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaeisolates.MethodsThe strains identification and antibiotic susceptibilities were performed by VITEK-2 compact system.The genes of AmpC，ESBLs，MBL and KPC β-lactamases were screened by specific PCR.And genotypes were confirmed by DNA sequencing.PFGE and multilocus sequence typing (MLST) were performed.Results5Klebsiellapneumoniaeisolates were resistant to all antibiotics tested.Genotyping(PFGE) clustered 5K.pneumoniaeisolates into a single clonal type and MLST assigned them to sequence type 11.Theblaspan，baspan，blaspanand rmtB genes were present in four isolates.And Molecular testing verified the presence ofblaspan，blaspan，blaspan，blaspanandblaspangenes in aKlebsiellapneumoniaeisolate.ConclusionTo our knowledge,this is first report of coexistence ofblaspan，blaspan，blaspan，blaspanandblaspangenes in a clinicalKlebsiellapneumoniaisolate.It may herald the emergence of a new pattern of drug resistance.Surveillance of metallo-β-lactamases inenterobacteriaceaeis urgently needed to control and prevent the spread of these isolates.

Key words:Klebsiellapneumonia;Gene;blaNDM-1;blaKPC-2;ST11

(收稿日期：2014-05-07)

文献标识码：A

中图分类号：R378

文章编号：1007-4287(2015)05-0744-04

*通讯作者

基金项目：青岛经济技术开发区重点科技发展项目(2013-1-82)