穿心莲内酯对体外视网膜母细胞瘤细胞增殖与凋亡的影响



穿心莲内酯对体外视网膜母细胞瘤细胞增殖与凋亡的影响

辛浩蓉1,闫东君2*,王旭飞1

(1.吉林省人民医院 眼科， 吉林 长春130021;2.吉林大学中日联谊医院 眼科，吉林 长春130033)

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)是婴幼儿期最常见的眼内恶性肿瘤， 严重损害患儿的视力，并对生命健康产生威胁[1]。临床工作中，常用的眼球摘除、外放射治疗、化学治疗对于患儿的心理和身体状态的考验、损伤都是比较大的 。细胞增生增加是所有肿瘤失控性生长的主要分子生物学机制之一[2]，因此，探索抑制RB细胞增殖活性、毒副作用较小的药物，对眼内恶性肿瘤的治疗具有重要意义。

近年来历史悠久的中药在多种抗肿瘤药物中占据了较为突出的优势，没有明显的毒副作用是众多化学治疗药物所不能及的。穿心莲内酯(Andrographolide， AD)是传统中草药爵床科植物穿心莲中提取出来的一类二萜类化合物,它通常作为一种消炎解毒药物用于治疗各种感染性疾病[3]。现代药理活性研究表明，AD除了传统的抗病毒作用外，也具有抗肿瘤的潜能[4，5]。目前，已经有将穿心莲内酯作为有效成份的滴眼液用于眼部炎症的临床治疗，但是穿心莲内酯对眼内肿瘤RB有何影响，尚不清楚。本研究旨在观察AD 对人视网膜母细胞瘤 HXO-Rb44细胞的增殖和凋亡的何影响。

1材料与方法

1.1药品和细胞株穿心莲内酯(纯度>98%)购自Sigma- Aldrich 化学制品公司，用RPMI-1640培养液溶解，配制成 100 μg/ml的溶液滤过除菌保存备用。人RB细胞株HXO-Rb44，购自中南大学湘雅医学院肿瘤研究所。

1.2主要试剂和仪器RPMI-1640(美国Hyclone公司)，类标准胎牛血清(中美合资兰州民海生物工程有限公司)，噻唑蓝 (美国Sigma公司)，异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V(AnnexinV-FITC)/碘化丙啶(propidium iodine，PI)双染试剂盒(美国Sigma公司)。二氧化碳恒温培养箱(德国Heraeus公司)，低温细胞涂片离心机，流式细胞仪(美国Becton Dikinson公司)。

1.3细胞培养人视网膜母细胞瘤系 HXO-Rb44采用10%胎牛血清，青、链霉素各100 U/ml，RPMI-1640培养液，在37℃、5%CO2孵箱内培养，每3天更换培养基或进行细胞传代培养。倒置相差显微镜观察细胞形态和生长状态，细胞悬浮状态生长，选取对数生长期细胞用于实验。

1.4噻唑蓝比色法(MTT)测定细胞增殖收集对数生长期HXO-Rb44细胞，制备成密度为5×105/ml细胞悬液，接种到96孔板，80 μl/孔，根据相关文献结合预实验结果，在96孔板中分别加入不同浓度的AD液20 μl/孔，使终浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/ml， 另一组加入RPMI-1640培养液20 μl作为空白对照组。每个浓度加6个孔，共同置于37℃、5%CO2孵箱内培养24 h后，加入MTT液作用4 h，再加入酸化的10%十二烷基硫酸钠(SDS)溶解12 h，采用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度(A)值，计算出穿心莲内酯对HXO-Rb44细胞的增殖抑制率及药物的半数抑制浓度(IC50)。

1.5流式细胞仪测定细胞凋亡率收集对数生长期细胞，制备成密度为5×105/ml，接种到100 ml培养瓶中，根据增长抑制率在50%以下的原则，选用IC50为30 μg/ml穿心莲内酯作为最佳实验药物浓度，对照组采用RPMI-1640替代AD，37℃孵箱内分别培养24 h、48 h后，离心收集，加入预冷的PBS洗涤。各取1 ml细胞， 依次加入10 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI，混匀，避光并在室温下反应20 min，流式细胞仪检测，以随机Cell Quest分析软件结果计算细胞凋亡率。

2结果

2.1　穿心莲内酯对HXO-Rb44细胞增殖活性的影响

2.5-80.0μg/ml浓度范围的AD对体外培养的HXO-Rb44细胞作用24h后，经过MTT检测，统计分析结果，不同浓度AD实验组的A值分别与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。计算出HXO-Rb44细胞增殖抑制率，实验结果(如图1)显示AD对HXO-Rb44细胞有明显的增殖抑制作用，并且随着AD浓度的增大，抑制作用逐渐增强，呈现一定的剂量依赖性。AD对HXO-Rb44细胞的IC50为(16.003±0.015μg)/ml。

图1　AD作用HXO-Rb44细胞后24h增殖抑制率

2.2　穿心莲内酯对HXO-Rb44细胞凋亡率的影响

根据MTT实验结果，增长抑制率在50%以下的原则，选用IC50为30μg/ml穿心莲内酯作为最佳实验药物浓度。16μg/mlAD分别作用HXO-Rb44细胞24h、48h后AnnexinV/PI双染流式细胞法检测细胞的凋亡率的变化，正常活细胞AnnexinV及PI均低染(AnnexinV-PI- ) ,分布在流式细胞分析图的左下区(LL) ；早期凋亡细胞AnnexinV高染而PI低染(AnnexinV+PI- ) ,分布在图的右下区(RL)；晚期凋亡及死亡细胞AnnexinV及PI均高染(AnnexinV+PI+ ) ,分布在图的右上区(RU)。将早期凋亡细胞百分数(RL)和晚期凋亡细胞百分数(RU)之和称为总凋亡率。结果(见图2)显示未经药物作用的对照组HXO-Rb44细胞的凋亡率仅为(1.61±0.09)%，AD作用24h后细胞凋亡率增加至(17.45±1.10)%，与对照组相比显著升高(P<0.01)。随着AD作用时间延长到48h，HXO-Rb44细胞的凋亡率逐步增加至(41.07±2.66)%。

A．正常对照组　B.AD作用24h组　C.AD作用48h组

3讨论

在我国视网膜母细胞瘤发病率居眼内恶性肿瘤之首，最常见于婴幼儿时期，患儿的早期就诊率较低，早已经不适宜保守治疗，常常需要眼球摘除术、化学治疗或外放射治疗以挽救生命，这种破坏性较大的治疗方法对患儿的心理和生存质量都是巨大的考验。传统的治疗模式已经无法满足人们提高生存质量的需求，价格昂贵的放化疗同时带来的各种严重副作用和抗药性也限制了临床应用。因此，寻求新的治疗渠道和治疗药物成了近来研究热点。本实验通过体外观察中药穿心莲内酯对HXO-Rb44细胞的影响，为治疗视网膜母细胞瘤寻求新的药物。

穿心莲内酯(andrographolide,AD)是天然中药植物穿心莲的主要有效成分，为穿心莲二萜内酯类化合物主要成分之一，具有免疫调节、清热解毒、消炎利胆等作用。近年来，随着现代药理研究的多样化发展，穿心莲内酯在抗肿瘤方面具有良好的生物活性，为临床应用提供了理论依据。本实验发现，AD可抑制HXO-Rb44细胞的增殖，且在一定范围内呈剂量依赖性，表明AD有作为药物治疗RB的潜能。

MTT法是一种经典的检测细胞增生活性的方法，已广泛用于抗肿瘤药物筛选，具有灵敏度高、 重复性好、 操作简单的特点。本实验中采用MTT法对AD抑制人HXO-Rb44细胞增殖的作用进行了测定，并计算出2.5-80.0μg/mlAD对HXO-Rb44细胞的抑制率和IC50，发现AD能够明显的抑制HXO-Rb44细胞的增殖，治疗效价较好，随着药物浓度的增加，抑制率也逐渐的增加，具有一定的剂量依赖性。此外，作为反应药物对肿瘤细胞敏感性的指标IC50也提示AD对HXO-Rb44细胞的敏感性较高。

肿瘤的发生发展与诸多因素相关，如细胞增殖的增强、凋亡的抑制、新生血管形成等方面，增生与凋亡的平衡失调是肿瘤细胞的生物学特性之一。因此我们检测了AD作用后HXO-Rb44细胞的凋亡率。细胞凋亡，即程序性细胞死亡,在许多生理和病理调节过程中发挥着重要作用,其定性和定量检测对于基础和临床用药研究都有指导意义。本实验中经过AnnexinV/PI双染后流式细胞仪检测，AD作用24h后的HXO-Rb44细胞凋亡率从对照组1.61%增加至17.45%，随着时间延长，细胞凋亡率继续增加，呈现一定的时间效应。

综合上述，本实验研究结果显示AD能够抑制HXO-Rb44细胞增殖，并且促进细胞凋亡，为AD加入RB的综合治疗提供了一定的发展依据，但其具体的调控靶点和相关作用机制还有待进一步深入研究。

参考文献：

[1]李凤鸣,主编.眼科全书[M].北京：人民卫生出版社,1996：2382-2390.

[2]ZhouBB,ElledgeSJ.TheDNAdamageresronse：puttingcheckpointsinperspective[J].Nature,2000,408：433.

[3]LeeJC,TsengCK,YoungKC,etal.Andrographolideexertsanti-hepatitisCvirusactivitybyup-regulatinghaemeoxygenase-1viathep38MAPK/Nrf2pathwayinhumanhepatomacells[J].BrJPharmacol,2014,171(1)：237.

[4]LinHH,TsaiCW,ChouFP,etal.Andrographolidedown-regulateshypoxia-induciblefactor-1alphainhumannon-smallcelllungcancerA549cells[J].ToxicolApplPharmacol,2011,250(3)：336.

[5]KuttanG,PratheeshkumarP,ManuKA,etal.Inhibitionoftumorprogressionbynaturallyoccurringterpenoids[J].PharmBiol,2011,49(10)：995.

(收稿日期：2014-06-09)

文章编号：1007-4287(2015)05-0716-03

*通讯作者

基金项目:吉林省卫生计生委科研课题(2014ZC024)