贝那普利与氯沙坦对糖尿病大鼠的心肌保护作用

周　煜，熊世熙

贝那普利与氯沙坦对糖尿病大鼠的心肌保护作用

周煜，熊世熙

摘要：目的观察贝那普利与氯沙坦对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡、纤维化的干预效果，探讨两者对糖尿病大鼠心肌保护的作用机制。方法将40只SD大鼠随机分为空白对照组(n=10)和糖尿病模型组(n=30)，糖尿病模型组用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建模，成功后再随机分为糖尿病对照组(n=10)、贝那普利治疗组(n=10)和氯沙坦治疗组(n=10)。贝那普利治疗组给予贝那普利10 mg/(kg·d)灌胃，氯沙坦治疗组给予氯沙坦20 mg/(kg·d)灌胃，糖尿病对照组和空白对照组给予相同体积的生理盐水灌胃。给药9周后，观察各组心肌细胞凋亡、心肌组织Fas蛋白表达，Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量，血清转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)蛋白表达的变化。结果与空白对照组比较，糖尿病对照组血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的含量明显增多(P<0.05)，Fas蛋白表达率、凋亡指数明显升高(P<0.05)，心肌细胞凋亡明显增多；Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显增多(P<0.05)，存在间质纤维化，同时TGF-β1、TIMP-1蛋白表达增多(P<0.05)，MMP-1表达减少(P<0.05)。与糖尿病对照组比较，贝那普利治疗组和氯沙坦治疗组Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量明显减少(P<0.05)，TGF-β1、TIMP-1蛋白表达减少(P<0.05)，MMP-1表达增多(P<0.05)；Fas蛋白表达率、凋亡指数明显降低(P<0.05)，贝那普利治疗组AngⅡ的含量明显减低(P<0.05)，氯沙坦治疗组AngⅡ的含量升高但差异无统计学意义。贝那普利治疗组与氯沙坦治疗组组间Fas蛋白表达率、凋亡指数及各项纤维化指标比较差异无统计学意义。结论糖尿病大鼠的心肌细胞凋亡明显增加，间质纤维化增加。贝那普利和氯沙坦均能抑制心肌细胞的凋亡和间质纤维化。

关键词：糖尿病；贝那普利；氯沙坦；血管紧张素Ⅱ；细胞凋亡；心肌纤维化

糖尿病性心肌病，虽然其发病机制尚未完全研究明确，但是可以观察到存在着纤维化和心肌细胞凋亡，这能够较好的解释糖尿病心肌病的临床现象。本实验在成功建立糖尿病大鼠模型后，分别应用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)贝那普利、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(ARB)氯沙坦药物进行干预，探讨其对心肌细胞凋亡和纤维化的影响及可能的作用机制。

作者单位：武汉大学中南医院(武汉 430071)

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂链脲佐菌素(STZ)为Sigma公司产品，AngⅡ放射免疫分析试剂盒购自北方生物技术研究所，兔抗鼠Fas蛋白多克隆抗体为美国Santa Cruz公司。

1.1.2动物分组健康雄性大鼠40只，体重205 g～245 g(225 g±10 g)，购自武汉大学动物实验中心。随机分为正常对照组(10只)和糖尿病组(30只)，适应性喂养5 d。5 d后，糖尿病组禁食12 h，在左下腹腹腔内一次性注射STZ(用0.1 mol/L枸橼酸钠缓冲液溶解，pH=4.5)50 mg/kg。同时，正常对照组注射同等剂量的枸橼酸钠缓冲液。3 d后断尾，测血糖值及尿糖定性。如若空腹血糖持续3 d≥13.8 mmol/L，尿糖定性≥+++，大鼠出现“三多一少”症状，则表示模型建立成功。随后随机分为糖尿病对照组、贝那普利治疗组、氯沙坦治疗组，每组10只，4组大鼠以同样的方式饲养10周。

1.2方法

1.2.1标本采集无菌条件下心脏取血，常规生化检测血糖、总胆固醇(TC)和三酰甘油(TG)，并取部分心肌组织10%甲醛固定。

1.2.2AngⅡ检测放射免疫法检测心肌局部AngⅡ含量，取新鲜的左室心肌100 mg，采用AngⅡ放射免疫试剂盒，按照说明书测定AngⅡ含量。

1.2.3心肌组织Fas蛋白表达率检测采用SP免疫组化法检测，10%甲醛固定24 h后石蜡包埋切片，抗原染色，按染色试剂说明书进行操作。显微镜下在阳性表达区域随机选取5个无重叠视野，取OD值的平均值作为各标本的蛋白表达。

1.2.4原位心肌细胞凋亡检测取左心室前壁心肌制作组织切片，使用原位细胞凋亡试剂盒检测凋亡细胞切片。光镜下随机选择5个视野，计算视野中每300个有核细胞中阳性细胞占的百分比，取平均值作为凋亡细胞阳性指数(AI)。

1.2.5其他Ⅰ型、Ⅲ型胶原，血清转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)蛋白表达检测采用免疫组化法。取左心室心肌组织甲醛固定，石蜡包埋，切片，抗原染色后于显微镜下观察。每张切片随机选取5个视野测OD值取平均值。

2结果

2.1模型建立30只糖尿病大鼠均建模成功，实验过程中糖尿病大鼠与正常对照组相比，活动减少，多尿、多饮、多食。在整个实验期间所有大鼠均未使用抗生素及降糖药物。HE染色可见糖尿病心肌组织有灶性坏死，纤维间可见成纤维细胞活跃，纤维紊乱，心肌间细小动脉血管壁明显增厚，有纤维化和玻璃样变性，血管腔狭窄。

2.24组大鼠血糖、TG、TC比较与空白对照组相比，糖尿病组大鼠血糖、TG、TC水平均增高(P<0.05)；贝那普利组、氯沙坦组血糖、TG、TC水平与糖尿病对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1　4组大鼠血糖、血脂比较(±s) 　mmol/L

2.34组大鼠心肌组织AngⅡ、AI、Fas蛋白表达率的比较与空白对照组比较，糖尿病对照组AngⅡ含量、Fas蛋白表达率、凋亡指数均显著增高(P<0.05)；与糖尿病对照组相比，贝那普利治疗组Fas蛋白表达率、凋亡指数均显著降低(P<0.05)，AngⅡ含量明显降低(P<0.05)，氯沙坦治疗组AngⅡ含量升高但差异无统计学意义，Fas蛋白表达率及凋亡指数显著性降低(P<0.05)。氯沙坦治疗组Fas蛋白表达率及凋亡指数稍高于贝那普利治疗组，差异无统计学意义。详见表2。

表2　4组大鼠心肌组织AngⅡ、AI及Fas蛋白表达率的比较(±s)　%

2.44组大鼠心肌纤维化指标表达的比较与空白对照组比较，糖尿病对照组TGF-β1和TIMP-1蛋白表达增多(P<0.05)，胶原Ⅰ型和胶原Ⅲ型含量增多(P<0.05)，存在明显的间质纤维化，MMP-1表达减少(P<0.05)。与糖尿病对照组比较，TGF-β1和TIMP-1蛋白表达减少(P<0.05)，胶原Ⅰ、Ⅲ含量减少(P<0.05)，MMP-1表达增多(P<0.05)。氯沙坦治疗组纤维化指标稍好于贝那普利治疗组，但差异无统计学意义。详见表3。

表3　4组大鼠心肌纤维化指标表达的比较(±s)

3讨论

很多研究表明糖尿病心肌病为心肌的一种特异性病变[1]。糖尿病心肌病发生发展过程尚不明确，影响因素众多，如物质代谢紊乱、肾素-血管紧张素(RAS)系统激活、氧化性损伤、心肌凋亡、纤维化等[2]。许多动物实验已表明，在高血糖状态下心脏局部的AngⅡ含量明显增加。心脏局部AngⅡ参与了糖尿病心肌病的心肌重塑过程[3]。糖尿病心肌病大鼠血浆中及心脏局部AngⅡ含量都明显升高。有实验表明即使将血浆AngⅡ控制在正常范围内时也不能阻止心肌病变的进展。这提示在糖尿病心肌病变发生中起主要作用是心肌局部AngⅡ。因此可以认为，循环中AngⅡ主要导致外周血管收缩，醛固酮分泌增多，水钠潴留[4]。心脏局部AngⅡ则是由自分泌和旁分泌等方式释放近距离作用于附近的心肌组织，导致心肌细胞的肥大、凋亡及间质的纤维化而参与心室重塑[5]。心肌重塑包含两个方面的内容，一方面是心肌细胞的肥大、坏死和凋亡，另一方面则是间质的纤维化。Frustaci等[6]研究发现AngⅡ可诱导产生心肌氧化性损伤，导致心肌细胞凋亡和坏死；糖尿病病人心肌细胞的凋亡发生率则远高于心肌细胞的坏死发生率。与单纯糖尿病比较糖尿病并发高血压时心肌细胞凋亡发生率并不增加。由此可知，在糖尿病心肌病病人中AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡在心肌重塑中发挥着重要作用。Fas，即CD95，为Ⅰ型跨膜糖蛋白，而FasL为Fas的特异性配体。Fas-FasL是非常重要的外源性细胞凋亡信号通路。许多活化的免疫细胞会在细胞表面表达FasL分子，与此同时相应的体内多种细胞在特定情况下也会在细胞膜上表达Fas分子，FasL通过作用于Fas分子，启动后者细胞内的caspase级联反应，导致凋亡的发生[7]。许多研究表明Fas-FasL在体内有着广泛的作用，几乎存在于人体的所有系统，与多种疾病密切相关，如免疫缺陷疾病、多种自身免疫疾病、肝脏炎症、糖尿病、移植排斥等，在心脏方面可能参与了急性心肌梗死、心肌炎、心力衰竭等多种心脏疾病中存在的心肌细胞凋亡过程。此外有研究表明心肌细胞自身可以重新合成和释放Fas，因此更能证明在糖尿病心肌病的进展中Fas-FasL系统参与了心肌细胞的凋亡。

心肌纤维化往往是由于心肌间质蛋白合成增加以及降解的障碍，特别是Ⅰ型、Ⅲ型胶原沉积，可导致心脏扩张、心力衰竭、心律失常、猝死等。有研究表明AngⅡ可以作用于血管紧张素Ⅱ受体(AT1)，导致胶原分泌增加。同时也有不少研究表明AngⅡ还可作用于成纤维细胞等使其合成并分泌TGF-β1。活化的TGF-β1是非常有效的致纤维因子，可以提高心肌基质多种蛋白的分泌(主要是胶原成分)。此外上调TGF-β1的表达，通过增加纤溶酶原激活物抑制物 1(PAI-1)的分泌，抑制MMP的活性，其中MMP-1为胶原酶主要水解Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维，导致Ⅰ型、Ⅲ型胶原堆积，从而产生纤维化[8]。TIMP-1则可以特异性抑制MMP-1，也可以部分反映心肌间质中胶原的代谢情况。

实验中糖尿病组大鼠的心肌局部AngⅡ含量明显增加，与此同时细胞凋亡指数升高、Fas蛋白表达率也明显上升，心肌细胞的凋亡明显增加。再观察各项纤维化的相关指标，致纤维化因子TGF-β1表达增加，MMP-1表达减少，TIMP-1表达增加，Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维堆积，可见心肌间质纤维化程度是有明显增加。心肌细胞的凋亡降低了心肌的收缩功能。间质的纤维化则使心室壁变得僵硬、顺应性减低从而影响舒张功能。

ACEI类药物主要作用于RAS系统中血管紧张素转换酶(ACE)，通过对ACE的抑制，减少AngⅡ的生成。本实验中贝那普利治疗组大鼠与糖尿病对照组比较，血糖、血脂未有明显改善，心肌局部AngⅡ明显减少，同时凋亡指数、Fas蛋白表达率降低，各种致纤维因子表达下降，细胞外Ⅰ、Ⅲ胶原减少。ACEI类药物可通过减少 AngⅡ的生成，抑制糖尿病心肌病大鼠的心室重塑。

ARB类药物主要作用于AngⅡ的AT1受体，而AngⅡ的大部分生物学效应是通过作用于AT1受体发挥作用的。有研究表明，AT1特异性阻断剂ARB类药物可以明显抑制心脏成纤维细胞前胶原的合成[9]，抑制间质胶原增生，改善心脏微血管基底膜增生。本实验中氯沙坦治疗组大鼠较糖尿病对照组心肌局部AngⅡ含量稍升高，差异无统计学意义，原因可能是循环中的AngⅡ通过AT1介导而在某些组织(如心、肾)中积聚，但这种作用几乎可完全被AT1受体拮抗剂所阻断，故来自循环中的AngⅡ减少。氯沙坦治疗组大鼠较糖尿病对照组凋亡指数、Fas蛋白表达率降低，各种致纤维因子表达下降；但是较贝那普利治疗组凋亡指数及Fas蛋白表达率稍高，各种致纤维因子表达稍低，差异无统计学意义。许多实验表明AT2在胚胎组织和已死亡的组织中有广泛表达，但成年体内很少表达。在心肌梗死、心力衰竭及皮肤损伤后又会重新表达，提示在病理情况下，AT2可能参与了组织的修复过程。关于AT2受体的作用还存在争议，但是用特异性激动剂和拮抗剂的实验证实AT2-R参与了调节发育、细胞增殖和凋亡[10]，具有一定的抗增殖、致凋亡作用。使用ARB类药物不仅阻断了AT1受体介导的心室重塑，但同时心肌局部升高的AngⅡ可以作用于AT2受体，可能发挥了一定的抗增殖、致凋亡作用。本实验中贝那普利治疗组和氯沙坦治疗组凋亡指标和纤维化指标差异无统计学意义，有研究表明不同剂量的沙坦类药物可以逆转不同程度的纤维化，因此推测可能与实验中氯沙坦的剂量有一定关系。

研究还发现，人类心脏局部AngⅡ只有约20%来自于ACE途径，大部分却是来自胃促胰酶(chymase)生成。在心脏疾病状态下表现得更为明显，可能是由于疾病状态下chymase被病理性激活。本实验中ARB组大鼠心功能与ACEI组比较无明显改善，可能是由于人与大鼠的物种差异导致。chymase存在多种同工酶，在人类是α-chymase可以裂解血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)生成AngⅡ，但在大鼠体内是β-chymase，并不能生成AngⅡ，大鼠体内AngⅡ基本上都是通过ACE生成的，因此ACEI类药物和ARB药物在实验中差异不明显。如果仅从阻断RAS的角度看，沙坦类药物优于ACEI类药物，但是两类药物作用的靶点、机制并不完全一样，两种药物同时使用更能获益，不仅是在抗凋亡还是抗纤维化方面，其具体的机制还有待进一步研究。

参考文献：

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(本文编辑郭怀印)

Cardioprotection of Benazepril and Losartan in Diabetic Rats

Zhou Yu，Xiong Shixi

Zhongnan Hospital of Wuhan University，Wuhan 430071，Hubei，China

Corresponding Author：Xiong Shixi

Abstract：ObjectiveTo explore the possible mechanism of benazepril or losartan improving myocardial interstitial fibrosis and cardiomyocytes apoptosis in diabetic rats.MethodsForty Sprague-Dawley(SD) rats were randomly divided into 2 groups，10 as normal control group and the other 30 as diabetic group which were induced by STZ，after the models were constructed successfully，randomly devided into diabetic control group，benazepril treated group，losartan treated group，each contains 10.Following the instruction，benazepril was administrated at the concentration of 10 mg/kg once a day，losartan was administated at the concentration of 20 mg/kg once a day，while in the diabetic control group and the normal control the same volume sodium chloride was administrated.After ten weeks，SP immunohistochemical staining was used to detect the level of Fas.Radioimmunity was used to measure the content of angiotensinⅡ(AngⅡ).Immunohistochemistry was used to measure the levels of typeⅠcollagen，type Ⅲ collagen，transforming growth factor (TGF)-β1， matrix metalloproteinase (MMP)-1， tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP)-1 protein.ResultsCompared to the normal control group，the content of AngII increased significantly，the rate of expression of Fas increased significantly，the apoptosis index increased significantly；the expressions of type Ⅰ，type Ⅲ collagen，TGF-β1prptein，TIMP-1 protein also increased significantly，however，the expression of MMP-1 protein decreased significantly.Compared to the diabetic control group，all the indexes were greatly improved in benazepril treated group.In losartan treated group，all the indexes except AngⅡwere greatly improved.ConclusionBenazepril and losartan can improve obviously the myocardial inerstitial fibrosis，cadiocyte apoptosis in diabetic rats.

Key words：diabetes mellitus；benazepri；losartan；angiotensinⅡ；cadiocyte apoptosis；myocardial interstital fibrosis

(收稿日期：2015-04-03)

通讯作者：熊世熙，E-mail：xiongshixi@126.com

中图分类号：R587.1R255.4

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2015．18．010

文章编号：1672-1349(2015)18-2060-04