新型光纤二氧化碳激光豚鼠鼓膜造孔术实验学研究△

杨晓煜 任冬冬



·基础研究·

新型光纤二氧化碳激光豚鼠鼓膜造孔术实验学研究△

杨晓煜 任冬冬

目的 研究新型光纤二氧化碳(CO2)激光行鼓膜造孔术的可行性及对内耳结构和功能的影响。方法 40只豚鼠随机分为4组(1、2、3 W和3 W+生理盐水组)，前3组使用不同功率激光(1、2、3 W)在左耳鼓膜紧张部前下圆形造孔，第4组在左耳鼓室内注射生理盐水后再行3 W激光打孔。右耳均使用细针机械圆形造孔。比较各组穿孔愈合时间，术前和术后即刻、术后2周处死前行听性脑干反应检查了解听觉功能，术后2周行扫描电镜观察毛细胞超微结构的变化。结果 CO2激光造孔愈合时间较机械造孔明显延长(P<0.01);3 W 组激光造孔后出现耳蜗局部炭化，听阈不可逆升高，耳蜗外毛细胞静纤毛倒伏和脱落。鼓室注射生理盐水后行3 W激光鼓膜打孔也出现听阈不可逆升高，但是术后2周听阈有部分恢复，耳蜗毛细胞损伤轻微。结论 新型光纤CO2激光豚鼠鼓膜造孔术只要激光功率选择合适，临床治疗分泌性中耳炎伴有鼓室积液更安全、有效。 (中国眼耳鼻喉科杂志，2015，15：185-188)

激光；鼓膜；穿孔；耳蜗；豚鼠

近年来，激光已被广泛用于耳科疾病的手术治疗，以损伤小、定位精确、并发症少著称。手术中使用二氧化碳(CO2)激光已有20多年的历史。既往的CO2激光器必须与显微镜联合使用，使其广泛应用于各种精确手术，特别是耳科、声带手术。但是，通过导光臂输出的激光束，有时很难进入一些咽喉或是有角度的部位，因为激光束必须沿直线传播。为了解决这一问题，新型柔软的CO2激光光纤得以发明和应用。本实验通过研究CO2激光行鼓膜造孔术对内耳结构和听觉功能的影响，初步探讨这种新型光纤CO2激光在耳科应用的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 选用耳廓反射灵敏、电耳镜检查证实鼓膜正常，体重为250～400 g的健康红目雄性豚鼠(本院提供)40只，随机分为4组(1、2、3 W和 3 W+生理盐水组)，每组10只。前3组使用不同功率激光(1、2、3 W)在左耳鼓膜紧张部前下圆形造孔，第4组左耳鼓室内注射生理盐水后再行3 W激光打孔。右耳均使用细针机械圆形造孔，直径约0.5 mm(显微镜下用钩针测量直径大小)。分别于术后2周断头处死豚鼠。

1.2 激光照射方法 使用氯胺酮(40 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)混合液肌内注射麻醉成功后，在手术显微镜(OPMI 9-FC，Zeiss公司，德国)下，采用新型CO2激光治疗机和FiberLase CO2激光光纤(AcuPulse 40WG，Lumenis公司，美国)，光纤输出端光斑直径为485 μm，工作距离3 mm(由于激光散射角很小，所以光纤的工作距离可以达到3 mm，而且无需与组织接触)。使用脉冲(SP)模式1次，持续0.1 s。以左耳为激光照射耳，分别以1 W(54.1 J/cm2)、2 W(108.2 J/cm2)和3 W(162.3 J/cm2)行鼓膜前下象限打孔，造孔直径约0.5 mm。激光造孔术后每天在电耳镜下观察和记录穿孔愈合情况。

1.3 听性脑干反应阈值的检测 在隔声静电屏蔽室内，分别于术前半小时，术后即刻和术后2周行双耳听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)检测。ABR检测使用听觉脑干诱发电位仪(AEP windows V 1.3.0, Bio-Logic公司，美国)，以click短声刺激。参考电极接于测试耳耳垂或乳突皮下，记录电极接于颅顶双耳中间，接地电极接于对侧耳耳垂或乳突部皮下。该机器对于正常豚鼠使用耳塞测试的正常听阈为 30 dB SPL左右。

1.4 耳蜗标本扫描电镜的制作 术后2周各组检测ABR后，断头处死豚鼠，分别快速取出听泡，在立体显微镜(解剖显微镜)(Stemi 2000，Zeiss公司，德国)下刺破圆窗膜，从蜗尖行2.5%戊二醛灌注并固定12 h，立体显微镜下按耳蜗铺片法，剥去蜗壳，除去螺旋韧带和前庭膜、盖膜，制成耳蜗标本,1%锇酸后固定 1 h 后，0.1 mm/L磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)漂洗。将耳蜗标本放于2%单宁酸中浸2次，每次30 min，PBS漂洗3次，每次20 min。经梯度乙醇脱水，临界点干燥(EM CPD300，Leica公司，德国)。固定于钢座上，经离子溅射仪(E-1045，Hitachi公司，日本)镀膜行扫描电镜SEM-LV(NOVA NanoSEM 230，Fei公司，美国)观察。

1.5 统计学处理 所有数据以均数±标准差表示，用SPSS 17.0统计软件包进行成组样本的t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察 4组左耳分别行不同功率激光鼓膜前下象限打孔，右耳对照组使用细针机械打孔，均使得穿孔直径达0.5 mm。术后即刻在显微镜下见1、2 W组和3 W+生理盐水组鼓膜穿孔边缘光整，中耳鼓室和耳蜗未见明显黑色炭化样物。但是单纯3 W激光造孔组，可见耳蜗鼓岬处黑色炭化明显。术后第3天开始3 W激光组就开始有豚鼠死亡，至术后2周，3 W组豚鼠死亡3只，考虑可能术后炎症反应较强，进食差或感染死亡。术后2周发现1 W组豚鼠1只、2 W组豚鼠2只、3 W组豚鼠2只和 3 W+生理盐水组豚鼠2只中耳感染，中耳较多脓性分泌物，故给予排除计数。

2.2 穿孔愈合时间观察 激光造孔后1周后电耳镜下观察每组双侧鼓膜愈合情况，因为之前预实验观察1周内鼓膜穿孔均不会愈合，并记录每组实验组和对照组时间(表1)，其中4组实验组与对照组愈合时间差异均有统计学意义(P<0.01)，说明激光行鼓膜打孔比传统的机械穿孔愈合时间稍长。

表1 激光照射后实验组与对照组鼓膜穿孔愈合时间±s)

注：a表示各组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)

2.3 ABR测试 所有豚鼠于打孔前、打孔后即刻和2周后处死前行ABR测试(表2)。从表2中可见，激光打孔后即刻1 W组ABR阈移与对照组比较无明显差异(P=0.78)，但是2、3 W组和3 W+生理盐水组术后即刻ABR阈移与对照组比较有明显差异(P<0.01)；激光打孔后2周观察发现，1 W组和2 W组ABR阈值均基本回复到术前水平，与对照组比较无明显差异(P值分别为0.7和0.2)，但是3 W组和 3 W+生理盐水组阈移与对照组比较有差异(P<0.01)。虽然3 W+生理盐水组阈值比术后即刻有所降低，但是仍然未回复到术前水平。

表2 激光鼓膜打孔前后各组豚鼠ABR阈移检测

组别打孔后即刻阈移打孔后2周阈移1W组21.50±3.373.33±2.502W组32.00±3.5a5.00±3.783W组41.50±3.37a49.00±4.18b3W+生理盐水组40.50±3.69a23.75±3.54b,c对照组20.50±3.693.00±2.58

注：a表示打孔后即刻ABR阈移与对照组比较有差异(P<0.01)；b表示打孔后2周ABR阈移与对照组比较有差异(P<0.01)；c表示改组术后2周阈移与术后即刻阈移有明显差异(P<0.01)

2.4 扫描电镜观察 术后2周行ABR测试后断头处死豚鼠，取耳蜗做扫描电镜观察发现，3 W激光鼓膜打孔组，耳蜗底中回3排外毛细胞中均见部分静纤毛脱落破坏，表皮板部分有裂开(图1A)，内毛细胞完整，且排列整齐。正常对照组、1 W组和2 W组(图1B)，外毛细胞排列基本正常，未见明显破坏和脱落。

图1. 术后2周扫描电镜观察发现，3 W激光鼓膜打孔组，耳蜗底中回3排外毛细胞(白色箭头)中均见部分静纤毛脱落破坏，表皮板部分有裂开(A)，内毛细胞完整排列整齐。正常对照组、1 W组和2 W组(B)，外毛细胞排列基本正常，未见明显破坏和脱落。IHC为内毛细胞，OHC1为第1排外毛细胞；OHC2为第2排外毛细胞；OHC3为第3排外毛细胞 ×5 000

3 讨论

分泌性中耳炎是耳科常见病和多发病，尤其多见于儿童，传导性聋和鼓室积液病程较长，在一定程度上影响着患儿的生活。一般认为与咽鼓管功能障碍、感染和自身免疫失调所致中耳分泌、吸收和排泄障碍引起中耳积液有关。既往有报道[1]指出，激光治疗分泌性中耳炎具有操作简单、时间短、伤口愈合慢、痛苦小、疗效好等优点，有较好的临床应用价值。激光波长及其射线束特征提供了有效的能量来源，用于切割和消融含水量高的组织。最早在1995年开始报道钬激光用于鼓膜照射引起的改变[2]，国内外许多学者相继使用CO2激光[3]行动物鼓膜手术，证明其安全性和有效性。

激光鼓膜打孔手术可以避免鼓膜置管和全身麻醉手术，因此值得推广，尤其适合门诊手术[4]。本实验选用新型FiberLase CO2激光波导技术和AcuPulse波导(WG)激光系统，使得用小纤维、转角、可弯曲手柄和纤维内镜直接照射组织成为可能。采用该光纤型CO2激光进行鼓膜打孔，提供了清晰的瞄准光束，可用于定位不可见的CO2激光能量，充分保障了手术安全。本实验通过不同激光功率大小进行鼓膜打孔，了解该新型激光行鼓膜打孔的可行性和合适参数。实验发现，在激光功率为1、2、3 W和3 W+生理盐水组，鼓膜穿孔愈合时间均较对照组机械损伤组长。有研究[1]表明，如果激光打孔后鼓膜过早愈合而鼓室内仍有积液者可以再次接受激光鼓膜造孔治疗，手术较安全。造孔主要是利用激光热效应减少穿孔边缘的血供，延迟穿孔愈合。造孔直径控制在2～4 mm，有利于中耳腔的通气、引流，促进咽鼓管功能的恢复，疗效较好，治愈率和好转率达68.8%。

为探讨新型FiberLase CO2激光鼓膜造孔的安全性，本实验对于1、2、3 W组和3 W+生理盐水组术前和术后即刻、术后2周均行ABR检测听觉功能的改变，发现鼓膜穿孔对于ABR是有影响的。1 W组术后即刻和对照组ABR阈移没有明显差异，本实验中说明鼓膜穿孔一般影响ABR阈移在17～24 dB SPL，在2、3 W组和3 W+生理盐水组术后即刻ABR阈移与对照组比较有差异，说明激光在术后即刻可能造成了轻微的内耳损伤。我们选择术后2周处死小鼠行听力学和形态学检查，主要是因为激光所造的穿孔愈合时间基本上在术后2周，所以检查鼓膜愈合的各组豚鼠ABR阈值改变，发现1 W和2 W组阈值基本回复到术前水平，与对照组比较阈移无明显差异；而3 W组和3 W+生理盐水组阈值仍然没有回复到术前水平，与对照组比较有明显差异，说明内耳有不可逆性损伤。3 W+生理盐水组术后2周阈值较术后即刻有明显改善(P<0.01),说明生理盐水有明显保护内耳的作用。CO2激光是水溶性激光，适合用于含水丰富的组织和器官，不易穿透。另外在大功率3 W组术后有3只豚鼠死亡，主要原因考虑为激光功率过大，耳蜗损伤严重引起感染死亡可能。而在3 W+生理盐水组未见死亡豚鼠，这也再次说明生理盐水减少了激光的损伤，所以在分泌性中耳炎有鼓室积液中使用是比较安全的。结合扫描电镜观察耳蜗的毛细胞超微结构同时证明，3 W 激光功率对内耳外毛细胞有一定的损伤作用，尤其在中底回外毛细胞，每层外毛细胞均可见静纤毛部分或完全脱落、倒伏和表皮板裂开，与听觉功能的改变基本一致。本实验说明，使用合适功率密度如1 W(54.1 J/cm2)和2 W(108.2 J/cm2)的FiberLase CO2激光豚鼠鼓膜造孔是安全的。有报道[5]表明，豚鼠耳蜗对声损伤的敏感度是人类的10倍以上，因此本实验的激光剂量用于人类是很安全的。有报道[1]使用CO2激光鼓膜打孔功率一般为8～10W(连续脉冲)，临床使用也是安全、有效的。

近几年也有许多报道说明激光鼓膜造孔治疗分泌性中耳炎有较高的复发率，有文献[6-7]报道激光鼓膜打孔治疗分泌性中耳炎的儿童有效率为40%～83%，其中有手术失败，需要再次行鼓膜置管手术。这个结果的差异与手术选择何种病例有很大关系。有报道[8]表明，如果单纯激光打孔对于儿童双侧分泌性中耳炎效果不佳，不如传统的全身麻醉下鼓膜置管手术；但是在需要重复置管的患儿可以考虑局部麻醉下激光打孔+鼓膜置管手术，可以减轻反复手术的风险；对于不严重的分泌性中耳炎的患儿局部麻醉下激光打孔或激光打孔+鼓膜置管手术比全身麻醉下鼓膜置管手术要创伤小。内镜下鼓膜置管手术安全性较高，临床使用广泛；但和传统的显微镜下鼓膜置管相比都需要长期留置管在鼓膜上，易产生鼓膜瘢痕、钙化和永久性穿孔可能，影响患者的生活质量。CO2激光鼓膜打孔，可以清除内耳积液，引起的永久性穿孔并发症可能性小。另外激光照射可能会产生热效应，促进受损细胞功能恢复，加快中耳上皮细胞代谢，促进黏液排出，中耳黏膜恢复效果好[9]。

综上所述，激光治疗分泌性中耳炎有以下优点：①损伤小，可以反复进行，可以控制穿孔大小，没有异物反应；②操作简便，带有可以弯曲操作的光纤，准确度高，患者可在局部麻醉下进行，儿童也可以耐受，门诊可以完成；③手术时间短，一般1次激光脉冲即可造孔成功；④并发症少，很少引起鼓膜钙化和感音神经性聋[1,7,10]。新型光纤FiberLase CO2激光用于豚鼠鼓膜打孔安全、可行，只要功率密度控制在合适范围内不会造成内耳损伤。临床应用于分泌性中耳炎的治疗也是有理论根据的,值得推广应用。

[1] 唐旭兰, 周慧群, 殷善开. CO2激光鼓膜造孔术治疗分泌性中耳炎的近期疗效观察[J]. 听力学及言语疾病杂志, 2010，18(5):499-500.

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(本文编辑 杨美琴)

Research of fiber-enabled CO2laser tympanostomy in guinea pigs

YANG Xiao-yu， REN Dong-dong

Department of Otorhinolaryngology， Eye Ear Nose and Throat Hospital of Fudan University， Shanghai 200031， China

REN Dong-dong, Email: dongdong_ren@163.com

Objective To explore the feasibility of fiber-enabled CO2laser tympanostomy in guinea pigs and its influence on the structure and function of inner ear. Methods Forty guinea pigs were randomly divided into four groups. Guinea pigs belonging to the first three groups were treated with laser power(1，2，3 W) respectively for the left ear, while the forth group received intratympanic saline injection before 3W laser power. Laser treatment caused perforation on anterior inferior of pars tensa membrane tympani. Circular perforation was caused by needle for the right ear in all groups as controls. Otoscopes examinations were performed to evaluate the healing time of perforation. Auditory brainstem response(ABR) were accessed preoperatively， immediately and 2 weeks postoperatively. Morphological changes of hair cells′ microstructure were observed by scanning electron microscopy(SEM) 2 weeks postoperatively. Results The healing time of perforation of CO2laser-caused perforation was longer than needle-caused perforation(P<0.01). In 3 W CO2laser treatment group, part of cochlea carbonized, ABR threshold increased irreversibly and stereocilia of outer hair cells collapsed and disoriented. With previous intratympanic saline injection, ABR threshold increased immediately after laser perforation, but got partial restoration in 2 weeks with minor inner ear damage. Conclusions The new fiber-enabled CO2laser is effective and safe for secretory otitis media with effusion if the total amount of energy is kept within the limits. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:185-188)

Laser； Tympanic membrane； Perforation； Cochlea； Guinea pigs

国家自然基金青年-面上连续资助项目(81370022)；国家自然基金青年基金项目(81000413)；上海市卫生系统优秀青年人才培养计划(XYQ2013084)

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科 卫生部听觉医学重点实验室 上海 200031

任冬冬(Email：dongdong_ren@163.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.03.009

2015-01-14)