脂肪细胞去分化过程中脂滴丢失的调控机制研究进展

脂肪细胞去分化过程中脂滴丢失的调控机制研究进展*

李翼飞 综述王兆杰 审校

(遵义医学院第五附属(珠海)医院骨科， 广东 珠海 519100)

【摘要】低氧低血环境是去分化过程的起始条件也是脂肪细胞发生形态显著改变的重要诱导因素。利用天花板培养法培养脂肪细胞，使其去分化成为前体脂肪细胞，此过程中最显著的形态变化是存在于脂肪细胞胞质中并占据脂肪细胞体积90%的脂滴的丢失，细胞由单房圆形变化为成纤维样细胞，并获得了多向分化潜能。本文基于去分化脂肪细胞(DA)的无血清培养，从低氧、低血等诱导因素方面综述脂肪细胞去分化的调控机制，为之后进一步研究去分化调控机制提供新的理论，并对脂肪细胞去分化的天花板培养提供简便可行的培养模式。本文查阅近10年有关低血低氧对脂肪细胞去分化影响的文献，并对脂肪细胞去分化过程中脂滴丢失的调控机制研究进展进行综述。

【关键词】去分化脂肪细胞; 脂肪组织 组织工程; 无血清培养

【中图分类号】R 446.8【文献标志码】A

基金项目：贵州省科技厅

收稿日期：( 2014-05-04； 编辑： 张翰林)

Research status of the mechanism of lipid drops lost during the process of adipocyte dedifferentiationLI Jifeireviewing,WANG Zhaojiechecking

(DepartmentofOsteology,TheFifthAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege(Zhuhai),Zhuhai519100,Guangdong)

【Objective】The conditions of hypoxia and free serum medium are the initial induce condition of the process of dedifferentiation, which lead to the change of aipocyte’s phenotype and functional gene.After ceiling culture, adipocyte shift into lipid-free fiberoblast-like cells, and regain mutilineage properties.We retrieved the recent 10 years literatures that correlate to adipocyte culture of hypoxia condition and free serum medium condition.

【Key words】Adipocyte dedifferentiation; Fat tissue tissue engineering; Serum-free medium

通信作者：王兆杰，《西部医学》编委，E-mail:zhaojiewang@163.com

去分化脂肪细胞(DA)因其来源广，数量充足，功能良好，稳定性强，纯度高，取材方便等特点，近年来备受关注。脂肪组织可以通过特殊信号调控免疫调节，而胞质中的脂滴占成熟脂肪细胞体积的90%，也因其存在表现出特定的细胞形态特点[1]。谓去分化[2]是指在一定信号和刺激因子作用下，已分化成熟的细胞和组织倒退分化，返回原始幼稚状态，这是一种通过自噬，胞质脱落，陈旧分泌物和残体外排等作用清除衰老的细胞器和细胞质成分以及细胞有害物质的过程。细胞质净化，细胞体变小，核仁重新出现，终末期分化细胞变成未分化状态祖细胞，去分化后的细胞往往可以恢复活力。1975年van等[3]首次发现成熟脂肪细胞在体外培养的过程中发生了形态上的变化，从单房圆形逐渐丢失胞质内的脂滴，呈成纤维细胞样[4]，在此过程中不仅细胞形态发生了改变，基因表达也发生相应改变，呈脂肪前体细胞的特征[5]。尽管DA近年来成为研究热点，并且初步应用于临床，但是去分化的机制、培养条件以等许多问题尚未解决。

1去分化脂肪细胞的培养

1.1天花板培养1986年由sugihara首次提出[10](见于表格1)，不同于脂肪间充质干细胞的下沉性，成熟脂肪细胞具有漂浮性，在装满培养液的培养瓶中，漂浮的脂肪细胞会贴住内壁，贴壁细胞会逐渐发生形态上的变化，大脂滴变为多个小脂滴，根据不同的研究显示[11-15]，经过 2~3周不加干预的培养后，脂滴逐渐消失，细胞形态逐渐变为成纤维样。

1.2改良天花板培养近年应用较多的是matsumoto提出的改良天花板贴壁法(16)，自脂肪组织中分离脂肪细胞的方法与前者相同，37℃条件下震荡消化一小时后以135g离心3min后，提取表面漂浮的脂肪细胞，于加入20%胎牛血清的DMEM中培养，7天后去除培养液并倒转培养瓶继续培养。并证实不用添加特殊细胞因子和条件进行诱导即可获得贴壁DA，但培养的同时仍需注意[17]:①由于脂肪组织含有多种细胞如脂肪细胞，脂肪干细胞，脂肪前体细胞，平滑肌细胞，血细胞，内皮细胞，成纤维细胞，外膜细胞等(11,18-21)，稍有不慎，这些细胞将会影响DA的纯度。为提高分离脂肪组织的纯度，充分的震荡和Ⅰ型胶原酶充分消化至关重要。此外，位获得高纯度DA，还要求对大体组织重复研磨、过滤、冲洗和离心。②在脂肪细胞开始接触培养瓶壁的时候尽可能不要干涉和移动是脂肪细胞成功去分化的关键。

1.3脂肪细胞的无血清培养国内王欢欢等等[48]利用无血清培养基培养猪成熟脂肪细胞，培养方法在天花板的基础上，使用了无血清的DMEM培养液，并且弃用低速的135g离心3min，而选用在500、800、1200g三个梯度离心后选取效果最好的800g离心15min漂洗，吸取1ml上清液至新的离心管，加入适量无血清培养液800g离心15min，取上清后，转移入到25cm3培养瓶中，加满无血清培养液于37℃，5%CO2条件培养，保证了脂肪细胞的纯度和提取效率。10d后成熟脂肪细胞完全去分化成为成纤维样脂肪前体细胞，行rt-PCR油红O等检测，证实成功获得DA。

2脂质代谢的相关功能基因、功能酶和细胞因子

2.1去分化过程中功能基因的改变在去分化过程中有362种基因下调，308种上调，其中下调的功能基因中几乎都是针对脂肪酸代谢的基因和脂滴代谢的基因发生了改变，包括ADIPOQ,LIPE,PDK4,LPL,FASN,PPARγ和FABP4，以上功能基因关系着脂滴形态的改变和甘油三酯以及脂肪酸的代谢[23]。而上调基因主要是与细胞形态发生改变、迁移、增殖分化的能力获得有着重要的决定作用。所以，脂滴的丢失主要与脂肪酸代谢和脂滴代谢的调控基因下调有关。

2.1.1PPARγ氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)是具有重要生物学功能的转录因子，可调控脂肪细胞分泌的多种蛋白质因子基因的表达[24]PPAR基因家族包括α、β和γ三种成员，在机体脂类代谢及脂肪细胞的分化中发挥重要作用，它是脂肪细胞基因表达和胰岛素细胞间信号转导的主要调节者，参与脂肪细胞分化和糖脂代谢的调节[25]，在脂肪细胞的分化过程中不仅能促进前体脂肪细胞的分化，而且也能促进非脂肪细胞转分化成脂肪细胞，与脂肪细胞生长分化关系密切。

2.1.2c/EBPα c/EBP蛋白因其能与启动子的CCAAT区及多种病毒增强子结合而得名[26]。Luft等指出[27]C/EBPα对成脂分化作用比PPARγ更大一些，但是c/EBPα对脂质代谢的调控依赖于PPARγ[28]。

2.2乙酰辅酶A羧化酶与脂肪酸合成酶动物体脂沉积[29]所需要的脂肪酸大多来自脂肪酸的从头合成(De novo fatty acid synthesis)，即由脂肪酸合成酶催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成脂肪酸，进而合成甘油三酯[30,31]。脂肪酸合成初始基础物质在乙酰CoA合成酶(ACS)的催化下合成乙酰CoA，然后在ACC催化下形成丙二酸单酰CoA，为脂肪酸合成提供原料，继而在FAS的作用下，催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成脂肪酸[32]。所以当FAS与ACC表达水平的升高时能够显著增加甘油三酯在细胞内的沉积[40]。

2.3TNFα、IL6 肿瘤坏死因子多由脂肪组织中存在的脱脂细胞分泌[33]白介素6则由TNFα诱导合成[37]，在脂质代谢的过程中Green等[6-8]发现TNFα下调脂肪表面标志物和相关功能基因的表达，如(9)c/EBPα，RXRα，PPARγ等基因，并通过[34]自分泌和旁分泌途径发挥刺激脂肪细胞分解，尤其是降低LPL的生成和活性，诱导脂肪细胞分化(破坏前脂肪细胞的分化，诱导成熟脂肪细胞逆分化)，加速脂肪细胞、前脂肪细胞凋亡的作用，以促成脂肪细胞的去分化。有研究表明[35]肥胖病人的脂肪组织可以诱导TNFα和IL6浓度的提升，所以推测脂肪沉积程度和脂肪细胞数量是TNFα和IL6分泌的诱导因素，并且通过抑制脂质合成来阻止脂肪的沉积和脂肪细胞数目的增长。

3去分化过程中脂滴丢失的调控机制

3.1脂肪细胞形态的改变廖云君等研究证实[2]，为了模仿局部低氧低血的内环境，在1%低浓度胎牛血清以及无氧条件下体外培养脂肪细胞10d，缺氧缺血可启动脂肪细胞脱去脂滴，圆形单房细胞移行成成纤维样细胞，从而实现去分化。而移植早期缺血缺氧的环境下，部分成熟脂肪细胞去分化，脱去脂滴，变成成纤维细胞样细胞，使细胞提高了耐受能力，并逃避宿主巨噬细胞的攻击[22]。证明了低血低氧培养基培养可以达到使脂肪细胞去分化的效果。

3.2脂肪酸的代谢改变国外研究者发现，肥胖患者脂肪组织中存在局部低氧的环境，低氧是诱导脂肪细胞凋亡的诱导因素。Yin等发现[36]，在低氧环境下，脂肪酸的积累减少，脂肪酸转运蛋白FATP1 和 CD36的表达受到明显的抑制，脂解作用增强，脂质代谢加速，造成了脂肪细胞胞质中脂滴的大量减少。

3.3功能基因的改变Luther等发现[38]局部低氧环境能诱导低氧诱导因子(HIFs)表达，HIFs能诱导AP-1转录相关因子Fra-2的表达上调，并且Fra-2能够给与PPARγ结合，并抑制PPARγ表达。还有学者研究发现[36]脂肪组织低氧环境(ATH)会加速脂质代谢，并且抑制转录因子PPARγ和 C/EBPα的表达，促使胞质中的脂滴合成减少。而金小岚等发现[39]，在不同低氧环境下诱导基质干细胞成骨分化时，与常氧组相比，各低氧组BMP-2蛋白和RUNX2表达呈不同程度的上调，并且氧浓度越低，表达上调越明显。RUNX2与PPARγ呈此消彼长的关系，而RUNX2的表达上调，表明PPARγ的表达下调，证明低氧培养能抑制干细胞的成脂分化。

3.4脂肪酶的改变 Semenkovich等[40]指出动物体脂水平和FAS的表达成正相关，而HSL水平与脂解活力呈强线性关系[41]，HSL是甘油三酯水解限速酶，能够抑制甘油三酯在脂肪细胞中的积累[42]。国内卢建雄的实验小组研究证明[43]，血清剥夺可以促使脂肪细胞去分化，依血清剥夺时间延长，脂肪细胞激素敏感酯酶mRNA水平显著增高，而FAS，ACC1水平显著下降，导致脂肪酸积累显著减少，脂滴逐渐缩小。无血清条件培养脂肪细胞36小时，细胞脂肪沉积下降22.6%，72h培养脂肪沉积下降50.7%，恢复血清条件培养后脂质沉积于36h，72h分别提高30.8%和65.4%。行rt-PCR后显示在无血清培养的条件下，FAS与ACC1mRNA水平显著下调，而恢复血清培养条件后恢复到正常水平。从而证明血清条件的剥夺使得HSL表达上调，FAS，ACC1表达下调，在脂滴丢失中起到了重要的生脂抑制和脂解加速作用，由此可以推断去分化过程中脂滴丢失与动物血清有密切的关系。

3.5细胞因子表达的改变白介素6(IL-6)和肿瘤破坏因子(TNFα)是由巨噬细胞分泌的炎性介质，可以抑制脂联素的表达[44]，从而可以抑制脂质代谢。不同实验小组验证[44，45]低氧条件可以抑制脂联素分泌，同时使得TNF-α和IL-6表达上调，并可激活NF-κB[46]通路，增加转录抑制子组蛋白去乙酰酶3(HDAC3)向细胞核内以为，来抑制PPARγ的活性[47]，从而使得脂质分解加速。

4小结与展望

去分化脂肪细胞具有来源广泛、存储丰富、抗衰老能力强、多向分化能力强、稳定性高、取材方便、同源性高等优点，是优秀的组织工程种子细胞。

在低氧低血的培养条件下，脂肪细胞发生了去分化，脂肪细胞的形态发生了变化，由单房圆形细胞，变成了成纤维样细胞，并且功能基因(PPARγ，C/EBPα)、脂肪酶(FAS,ACC1)、以及脂质代谢相关的细胞因子(TNFα、IL6)的表达都发生了相应的改变，使得脂质代谢增强，脂肪酸积累减少，甘油三酯合成减少，从而使脂质合成抑制，造成脂肪细胞胞质中的脂滴减少丢失。由此可认为低氧无血清的培养条件是启动脂肪细胞去分化的诱导因素之一。

目前的试验，细胞培养基中多加入了动物血清，但是血清中的成分复杂，并且有可能会引发动物疾病的感染和不必要的免疫应答反应，对试验的结果有可能产生干扰，对临床试验造成了相应的障碍，使得试验难以应用于临床研究。加入血清的培养基增加试验了的成本，并且是细菌的良好环境，容易造成培养基的污染。

骨折初期局部低氧低血的情况适合去分化脂肪细胞的生存环境，并有效抑制成脂分化趋势(去分化脂肪细胞具有耐低氧耐低血的环境)，可以为骨住址工程提供良好的种子细胞，而且无血清条件培养脂肪细胞可有效促进脂肪细胞去分化的过程，可以在天花板培养中考虑不加入血清，从而保证了实验效率和节省资源。目前国内无血清培养与加入胎牛血清培养基的去分化脂肪细胞多向分化能力比较试验实例甚少。其他调节途径对于脂肪细胞去分化的调控机制还未清楚，例如wnt信号通路调节的改变对于脂肪细胞去分化过程的影响，以及其他功能基因表达的改变在脂肪细胞去分化过程中发挥的作用等，这些问题有待于未来的试验提供明确的结果。

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回归分析中应正确使用r、R、R2三种符号

回归分析中所获取的r是相关系数，R是复相关系数(Frisch R, 1934)，R2是决定系数或相关指数。r是简单相关系数，描述两变量间相关关系，或直线回归中反应变量与自变量之间的相关关系。在多元线性回归(多重线性回归)分析中，R是复相关系数，回归平方和与总回归平方和之比的平方根，描述反应变量与多个自变量之间的线性相关关系。在多元线性回归(多重线性回归)分析中，R2是R的平方，称决定系数或相关指数，是回归平方和在整个反应变量平方和(总回归平方和)中所占比重，一般R2愈大表示回归模型拟合愈好；但R2过大，意味着可能存在多重共线性问题，常用容忍度(1-R2)、方差膨胀因子(VIF= 1/(1-R2))等指标判断，当容忍度小于0.1，或VIF>10提示存在多重共线性问题。

(四川大学华西公共卫生学院陈彬)