脂肪组织石蜡切片制作方法探讨

梁忠泉 ，刘畅，杨志娜，谢永新 ，袁昌隆*

（中国人民解放军联勤保障部队北戴河康复疗养中心1检验病理科，2全军肾病中西医结合治疗中心病理实验室，河北 秦皇岛066100）

脂肪组织在日常病理工作中非常常见，如脂肪瘤、胃肠道切取的大网膜，乳腺癌周围以及淋巴结周围脂肪组织等。脂肪组织是由大量群集的脂肪细胞构成，脂肪细胞间质很少，是一种特殊的结缔组织[1]。脂肪组织细胞内含有大的脂滴，细胞间缺乏纤维和血管，脂肪组织经常规处理后组织和石蜡不能很好的融合在一起，质地松软，蜡块在常温下表面易塌陷，很难制作成一张优良的病理切片，给病理阅片、后续研究带来一定困难。为了解决这一问题，我们在不影响正常工作、不增加工作时间和工作量的情况下不断探索，提高了脂肪组织的制片质量。

材料与方法

1 脂肪组织的来源

脂肪组织标本主要来源于我院外科手术标本，如脂肪瘤、多发性脂肪瘤、胃肠道恶性肿瘤切下的大网膜、乳腺癌乳腺根治标本、淋巴结周围的脂肪组织等。

2 试剂与设备

中性甲醛固定液（中性甲醛液的配制：取10%的甲醛液，加入碳酸镁至饱和，PH7.6）[2]，95%乙醇，无水乙醇，环保透明脱蜡液（北京中杉金桥公司），石蜡（上海华永石蜡有限公司，熔点56～58℃），自动组织脱水机（湖北孝感阔海医疗科技有限公司），组织包埋机（天津航天机电有限公司），LEICA-RM2135切片机，烘片机，摊片机，Harris苏木素染液，伊红染液等（染液均购自珠海贝索生物技术有限公司）。

3 脂肪组织取材、固定、脱水、透明、浸蜡

将随时送检的脂肪组织标本用取材刀从中间切开，特别大的可以多切两刀，然后固定于中性甲醛液中，每天上午取材时再将脂肪组织切取为2cm×1cm×0.3cm大小，放入微孔塑料包埋盒中，置自动组织脱水机上固定、脱水、透明、浸蜡，并改良机器各步骤的时间设置（表1）。

表1 改良前后固定、脱水、透明及浸蜡程序设定的比较Tab.1 Comparison of the fixation, dehydration, transparency and paraffin immersion process before and after optimization

4 肪组织的包埋

用眼科弯镊子将脂肪组织从微孔塑料包埋盒中取出，置于组织包埋机工作台加热板上，将眼科弯镊子在酒精灯上烤5s～6s, 然后用弯镊子在脂肪组织上从左到右从上到下来回轻轻均匀按压，直至将脂肪组织中的脂滴完全挤出为止（图1A），将挤压过的脂肪组织包埋制作成蜡块。

5 脂肪组织石蜡切片、染色

将包埋好的蜡块修切好后放在冷台上或冰箱内冷冻几分钟，LEICA-RM2135切片机切片，切片厚度5μm, 摊片机水槽内温度38℃～39℃（水槽中勿加酒精），烤片机温度调为60℃，将切片先树立在摊片机旁，待另一张切好后再平放烤片，以此类推，烤片时间15min～20min，常规苏木素 、伊红染色，环保中性快干胶封片，镜下观察。

结 果

经过以上程序和方法处理的脂肪组织蜡块无塌陷，组织和石蜡能很好的融合在一起，切片完整，无空洞、无挤压（图1B）、水槽中展片时蜡带完整，经苏木素、伊红染色后镜下观察脂肪组织厚薄均匀，结构完整清晰，细胞无挤压无重叠。形态清晰，着色均匀（图2B、2C）。

讨 论

脂肪组织石蜡切片往往是技术人员非常头痛的事，特别是年轻技术员，组织经过常规固定、脱水、透明、浸蜡、包埋后质地松软，切片非常困难，易出现空洞，破碎等情况，甚至难以切片，究其原因是脂肪组织本身结构和细胞特性所致。脂肪组织是由大量群集的脂肪细胞构成，而脂肪瘤则是由正常脂肪细胞增生而成，脂肪细胞的胞浆内含大量脂滴，有机溶剂不易渗透[3]，从而造成组织固定不充分，脱水透明不足，浸蜡渗透不完全等情况出现。当然脂肪组织可以通过长时间的充分固定，延长脱水、透明、浸蜡时间使脂滴完全溶解，石蜡充分渗入脂肪细胞和纤维组织中，由此做出的蜡块质地均匀从而能制作出优良的切片，但在病理科的实际工作中没有充足的时间也不可能将脂肪组织标本挑出来单独处理，除非是科研需要。

图1 A，在加热板上挤压脂肪组织标本； B，经改良方法处理的脂肪组织蜡块和切片；C，未经改良方法处理的脂肪组织蜡块和切片Fig. 1 A, extruding uniformly the adipose tissue specimen with elbow tweezers on the hot plate; B, the wax blocks and paraffin sections of the adipose tissues treated by improved methods. C, the wax blocks and paraffin sections of the adipose tissues without improved methods

图2 A，未经改良方法处理的脂肪组织的光镜下观察；B和C，经改良方法处理的脂肪组织的光镜下观；比例尺，100μmFig. 2 A, light microscopic view of the adipose tissues without improved methods; B and C, light microscopic view of the adipose tissues with improved methods; scale bar, 100μm

为了在不影响正常工作的情况下做出优质的脂肪组织切片，本研究中，首先我们采用中性甲醛液作为组织标本的固定液，由于加入了碳酸镁，pH7.6左右略显弱碱性，脂肪组织中的脂肪酸为酸性，根据酸碱中和的原理，以及甲醛具有穿透力强等特点有利于组织的固定。此外，在收到标本时就将标本剖开，从而加强了组织的固定，避免了脂肪瘤因为有完整的包膜，不利于固定液的穿透，影响脂肪组织充分固定的情况。

其次，在有脂肪组织标本时把取材时间提前到上午进行，将脱水机程序设定为中性甲醛固定液固定6h，95%乙醇Ⅱ2.5h，无水乙醇Ⅲ2.5h，环保透明液Ⅱ1.5h。由于增加了组织固定、脱水、透明时间，使组织得到充分固定，有利于有机溶剂对脂肪组织中脂滴的溶解，从而增加了组织的硬度，有利于切片。安排在上午取材的好处是不增加工作量，也不影响第2天的包埋切片等其他工作。

通过增加固定时间、延长脱水、透明、浸蜡时间等方法脂肪组织内的脂滴减少，对于残余的脂滴我们在包埋过程中将组织置于组织包埋机工作台加热板上，加热板上温度足以使脂肪组织内的脂滴呈液态，用眼科弯镊子在酒精灯上加热，然后在脂肪组织上轻轻均匀按压，将脂肪组织中没有溶解掉的脂滴尽可能挤出。通过按压可能对脂肪组织的细胞膜造成轻微损伤，脂滴从细胞膜小的裂隙处挤出。脂肪组织中除含有大量的脂滴外还含有不同程度的结缔组织、血管、平滑肌、胶原纤维等[4]，可以造成包埋后的组织硬度不一，若脂肪组织含量少其他组织含量多则切片顺利，反之则切片困难。通过按压可以使整块脂肪组织变得比较致密结实[5,6]。按压不仅挤出了脂滴，也挤出了浸入组织细胞内的蜡液，在包埋时由于脂肪组织细胞内存在一定的负压，蜡液通过细胞膜轻微的裂隙进入细胞内，细胞膜反弹而恢复细胞原有形态，脂肪组织经过充分的固定、脱水、透明、浸蜡和包埋时的均匀挤压，增加了脂肪组织的硬度，使组织和石蜡能很好的融合在一起，组织蜡块质地均匀，有利于切出完整的厚薄均匀的石蜡切片，提高了制片质量，为病理诊断和后续研究提供了前提条件。镜下观察脂肪组织细胞呈圆形或多边形，胞质由于脂滴被溶解或挤出而呈大的空泡状，胞核呈扁圆形，位于细胞一侧。经多年应用观察，均匀挤压组织不会对脂肪组织的镜下结构造成明显改变，且能很好的保持抗原，不影响最终的病理诊断。

最后，在切片前我们将制作好的蜡块放在冷台上或冰箱内冷冻，其目的是进一步增加蜡块和组织的硬度，在捞片时水槽内的温度控制在38～39℃之间且不加入乙醇。水温过高组织蜡带易散，加入乙醇后水面张力增加，组织蜡带更容易迅速散开，造成无法捞片。

通过一系列方法的改进，我们很好地解决了脂肪组织的制片问题，使包埋后的脂肪组织中很少含有脂滴甚至无脂滴，制作的蜡块无塌陷（图1B），切片顺利完整，组织结构层次清晰。

总之，作为技术人员，要认真学习，不断实践，勇于创新，把病理技术工作做精，著名病理学家Karl Lennert 教授曾说“技术是病理之母”，是推动科学发展的动力，一张优良的脂肪组织切片是病理诊断和科研的前提和基础[7,8]。熟练掌握脂肪组织的特殊结构，充分的固定，在不影响正常工作，不增加工作量的情况下适当延长组织的脱水、透明、浸蜡时间，尽可能的让有机溶剂将脂滴溶解，再加上包埋时将脂滴挤出，通过这些方法的改进制作出优良的切片。