调经益灵片质量标准提高研究

2015-02-23周军，张茉，王杰

天津药学 2015年2期

关键词：香附薄层批号

周军，张茉，王杰

(天津市药品检验所，天津 300070)

药品质量与检验

调经益灵片质量标准提高研究

周军，张茉，王杰

(天津市药品检验所，天津 300070)

目的：提高调经益灵片的质量标准。方法：采用薄层色谱法对制剂中的当归、川芎、香附、青蒿进行定性鉴别，采用高效液相色谱法测定了α-香附酮的含量。结果：薄层色谱中的特征斑点明显。α-香附酮在0.036 5～2.736 μg线性关系良好, 平均回收率为97.25 %, RSD为0.59 %(n=6)。结论：本法专属性强、准确、快速，可以作为该产品的质量控制方法。

调经益灵片，当归，川芎，香附，青蒿，白芍，牡丹皮，薄层色谱，α-香附酮，高效液相色谱法

调经益灵片是由香附、当归、川芎、白芍、青蒿、牡丹皮等13味药材制成的中药片剂，具有调经养血，开郁舒气的功效，用于妇人血虚气滞、腰酸腹痛、月经不调、赤白带下等各种妇科病。湖南德康制药股份有限公司生产的样品质量标准为《国家食品药品监督管理局标准(试行)》(YBH05342004)，标准中包括显微鉴别、薄层鉴别(当归、川芎、香附、青蒿、白芍)及白芍(芍药苷)的HPLC含量测定；天津市力生制药股份有限公司生产的样品质量标准为《卫生部药品标准中药成方制剂第十九册》(WS3-B-3669-98)，标准中包括显微鉴别、薄层鉴别(当归、川芎)。调经益灵片法定质量标准存在标准不统一，鉴别项提取方法较为烦琐、重现性差，未对处方中的君药(香附)进行含量测定的缺点，不能有效控制药品质量。本实验采用薄层色谱法对制剂中的当归(川芎)、香附、青蒿进行了鉴别，并采用高效液相色谱法测定处方中的君药香附中有效成分α-香附酮的含量，结果表明本法专属性强、准确、快速，使产品的质量得到有效的控制，保证了临床疗效。

1 仪器与试药

1.1 仪器岛津LC-20AD高效液相色谱仪，配有LC-20AD 泵、SIL-20自动进样器、SPD-20A紫外检测器、CTO-20AC柱温箱；LC-solution 色谱工作站；AS20500ADT 超声波清洗机(360 W，AUTO SCIENCE科技有限公司)；AG135 型电子天平(梅特勒-托利多公司)；硅胶G 薄层板(青岛海洋化工厂)。

1.2 试药调经益灵片样品：湖南德康制药股份有限公司(批号091001、090201、090601，薄膜衣片)，天津市力生制药股份有限公司(批号0906001，糖衣片)。α-香附酮(批号110748-201111)、芍药苷(批号110736-201136)、丹皮酚(批号110708-200506)、当归(批号120927-201014)、川芎(批号120918-201110)、青蒿(批号121016-201004)，均由中国食品药品检定研究院提供。甲醇为色谱纯，乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、环己烷、甲苯、冰醋酸、三氯甲烷、甲酸、二硝基苯肼为分析纯，水为去离子水。

2 鉴别

2.1 当归和川芎的薄层鉴别取本品20 片，除去包衣，研细，加乙醇50 ml，超声处理(功率350 W，频率40 kHz)60 min，滤过，滤液低温(40～60 ℃)蒸干，残渣加水20 ml使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次20 ml，合并乙醚液(水液备用)，低温蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取当归、川芎对照药材各1 g，分别加乙醚10 ml，超声处理10 min，滤过，滤液低温蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为对照药材溶液。再按处方配比，取处方药材适量(当归、川芎除外)制成阴性样品，按照供试品溶液的方法提取，作为阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述四种溶液各6～10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。结果见图1。

2.2 香附薄层鉴别取“2.1”项下的供试品溶液，作为供试品溶液。另取α-香附酮对照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再按处方配比，取处方药材适量(香附除外)制成阴性样品，按照供试品项下的方法提取，作为阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)[1]试验，吸取供试品溶液、阴性样品溶液各6～10 μl及对照品溶液2～4 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(92∶5∶5)为展开剂，取出，晾干，喷以二硝基苯肼试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。结果见图2。

1.-阴性样品 2.湖南样品1 3.湖南样品2

1.阴性样品 2.湖南样品1 3.湖南样品2

2.3 青蒿薄层鉴别取“2.1”项下乙醚提取后的水液，加乙酸乙酯提取2 次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液(水液备用)，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取青蒿对照药材1 g，加甲醇10 ml，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为对照药材溶液。再按处方配比，取处方药材适量(青蒿除外)制成阴性样品，按照供试品项下的方法提取，作为阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述三种溶液各6～10 μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(6∶6∶7∶1.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇，在105 ℃加热10 min，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。结果见图3。

1.阴性样品 2.湖南样品1 3.湖南样品2

2.4 白芍薄层鉴别取“2.3”项下乙酸乙酯提取后的水液，加水饱和的正丁醇提取2 次，每次20 ml，合并正丁醇液，加氨试液洗涤2 次，每次20 ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再按处方配比，取处方药材适量(白芍除外)制成阴性样品，按照供试品项下的方法提取，作为阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述三种溶液各6～10 μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰[2]。结果见图4。

1.阴性样品 2.湖南样品1 3.湖南样品2 4.湖南样品3 5.天津样品 6.芍药苷对照品

2.5 牡丹皮薄层鉴别取本品适量，除去包衣，研细，取10 g，置圆底烧瓶中，加水100 ml，连接挥发油提取器，自测定器上端加水使充满刻度，再加入石油醚(60～90 ℃)1 ml，缓缓加热至沸，并保持微沸1 h，放冷，取石油醚液作为供试品溶液。另取丹皮酚对照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再按处方配比，取处方药材适量(牡丹皮除外)制成阴性样品，按照供试品项下的方法提取，作为阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述三种溶液各6～10 μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(4∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。结果见图5。

1.阴性溶液 2.湖南样品1 3.湖南样品2 4.湖南样品3 5.天津样品 6.丹皮酚对照品

3 香附的HPLC法测定

3.1 色谱条件与系统适用性试验资生堂 SPOLAR-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相：甲醇-水(75∶25)；柱温：40 ℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：250 nm。理论板数按α-香附酮峰计算应不低于5 000[3-5]。

3.2 溶液制备

3.2.1 对照品溶液的制备取α-香附酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml中含α-香附酮28 μg的溶液，即得。

3.2.2 供试品溶液的制备取同一批号(091001)样品适量，研细，取0.5 g，精密称定，精密加入80%甲醇25 ml，称定重量，超声提取60 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，进样，测定，即得。

3.2.3 阴性样品溶液的制备按处方取除香附的各味药材，按【制法】制得样品，再按“3.2.2”项下供试品溶液制备方法，制得阴性样品溶液。分别精密吸取对照品、供试品和阳性样品溶液10 μl，依“3.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，阴性样品无干扰，见图1。

1.α-香附酮

3.3 标准曲线的制备取α-香附酮对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成浓度为每1 ml中含α-香附酮3.648、7.296、18.24、36.48、91.20和273.60 μg的对照品溶液，分别精密吸取10 μl，注入液相色谱仪，按“3.1”项下色谱条件分析，分别测定各自峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积值为纵坐标，得回归方程：Y=-2 024.26+1 816 990.05X(r=0.999 9)。结果表明α-香附酮在0.036 5～2.736 μg范围内线性良好。

3.4 精密度试验取同一批(批号091001)适量，研细，取0.5 g，精密称定，精密加入80%甲醇25 ml，按照“3.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“3.1”项下色谱条件分析，连续进样6次，测定α-香附酮峰面积，RSD为0.36%，符合要求。

3.5 重现性试验取同一批(批号091001)样品适量，研细，取0.5 g，精密称定，共6 份，分别精密加入80%甲醇25 ml，按照“3.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“3.1”项下色谱条件分析，测定，样品中α-香附酮的含量为1.359 6 mg/g，RSD为0.11%，符合要求。

3.6 稳定性试验取同一批(批号091001)样品适量，研细，取0.5 g，精密称定，精密加入80%甲醇25 ml，按照“3.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“3.1”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、16和24 h进样测定，RSD为1.61%，符合要求。

3.7 回收率试验取同一批(批号091001)样品适量，研细，取0.25 g，精密称定，共6 份，分别精密加入每1 ml中含α-香附酮0.014 59 mg/ml的80%甲醇对照品溶液25 ml，按照“3.2.2”项下供试品溶液制备操作，制得供回收率用供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件分析。计算回收率，结果α-香附酮平均回收率为97.25%，RSD为0.59%，结果见表1。

表1 α-香附酮回收率试验结果

3.8 样品测定取两个厂家4个不同批号的样品，按照“3.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“3.1”项下色谱条件分析，测定，计算样品中α-香附酮的含量，见表2。

表2 样品测定结果

4 讨论

4.1 在TLC鉴别试验中根据被测定药材中相应成分的性质对提取方法进行科学合理的安排：①采用乙醇提取出主要成分后，先用乙醚提取低极性的成分(当归、川芎、香附)，再用乙酸乙酯提取极性相对较大的成分(青蒿)，最后用正丁醇提取极性更大的成分(白芍)；②牡丹皮的处方量较小，并且直接用乙醚提取部分作为供试品溶液，展开后样品中存在其他杂质严重干扰的情况；根据丹皮酚具有挥发性的特点，采用提取挥发油的方式进行提取，结果满意。本文建立的薄层鉴别方法具有简便、杂质干扰小、重现性好的优点。

4.2 在本实验中建立的TLC鉴别方法，在不同品牌(青岛、烟台、默克)薄层板、室温条件、低温(≤10 ℃)、高湿(≥75 %)等影响因素下进行了耐用性试验。结果显示，上述因素对薄层鉴别效果均无显著影响，表明本实验建立的TLC方法可靠、稳定。

4.3 HPLC分析中分别采用甲醇-水(70∶30)、甲醇-水(75∶25)与乙腈-水(70∶30)为流动相进行试验[1-4]。结果，采用甲醇-水(75∶25)为流动相，供试品色谱中α-香附酮色谱峰与其他杂质峰分离较好，且峰形对称，故采用甲醇-水(75∶25)为流动相。

4.4 考查采用甲醇、90%甲醇、80%甲醇三种不同的提取溶剂[5-7]，分别采用加热回流提取及超声提取，最后确定以80%甲醇为溶剂超声处理提取较完全；经考查不同的提取时间，结果超声提取60 min样品中α-香附酮的量最高。

4.5 经测定两个厂家的4批样品，α-香附酮测定结果分别为0.417 9、0.032 3、0.173 5和0.312 0 mg/片，由测定值可以看出不同厂家和批号样品中α-香附酮的量相差极大，因此增加α-香附酮的测定对控制调经益灵片药品的质量有重要的意义。

4.6 文献报道[8]，测定调经益灵片中α-香附酮的方法是采用挥发油提取器提取后再进行测定，提取方法烦琐、费时，本文采用的方法专属性强、准确、快速，使产品的质量得到有效的控制，保证了临床疗效。

1 中国药典[S].一部. 2010:241，779

2 刘敏，楚生辉，曹高辉，等.调经益灵片质量标准研究[J].中国现代药物应用，2009，3(6):7-8

3 李姣，常增荣，傅欣彤.璇机化积膏质量标准研究[J].中成药，2012，34(8):1615-1618

4 李英美，张彬，范晓惠.白香丹胶囊中芍药苷、丹皮酚及α-香附酮的HPLC含量测定[J].中成药，2009，31(11):1690-1694

5 翟志光，牛欣，冯前进，等. HPLC测定良附口服液中α-香附酮的含量[J]. 中国中药杂志，2007，32(10):988-989

6 许波，苌玲，高玲，等.HPLC法测定心痛宁滴丸中α-香附酮的含量[J].中国药事，2008，22(10)：897-898

7 侯立静，吴丽丽，李英霞.不同产地香附和醋炙香附中α-香附酮含量测定[J].陕西中医，2011，32(4)：480-481