心可宁胶囊中非法添加物金橙Ⅱ和樟脑的检测研究

田 静，李 奇，闻琍毓

(江苏省扬州药品检验所，扬州 225009)



药品质量与检验

心可宁胶囊中非法添加物金橙Ⅱ和樟脑的检测研究

田 静，李 奇，闻琍毓

(江苏省扬州药品检验所，扬州 225009)

目的：建立心可宁胶囊中非法添加物金橙Ⅱ及樟脑的检测方法。方法：采用TLC、HPLC和LC-MS/MS法检测金橙Ⅱ；采用GC法检测樟脑。结果：金橙Ⅱ浓度在6.75～33.75 μg/ml范围内呈良好线性关系(r=0.999 9)，平均回收率为97.52%，RSD为1.3%(n=6)；樟脑浓度在3.2～980.1 μg/ml范围内呈良好线性关系(r=1)，平均回收率为101.33%，RSD为1.9%(n=6)。结论：本文所建立方法简便、灵敏、准确、重现性好、专属性强，可用于检测心可宁胶囊中的非法添加物金橙Ⅱ及樟脑。

心可宁胶囊，金橙Ⅱ，樟脑，薄层色谱法，高效液相色谱法，气相色谱法

心可宁胶囊由丹参、三七、红花、蟾酥、水牛角浓缩粉、牛黄、人参须、冰片等8味中药组成，具有活血散瘀、开窍止痛功能，用于冠心病、心绞痛、胸闷、心悸、眩晕等症。近年来红花存在用金橙Ⅱ染色现象[1]，有的厂家不重视原材料入厂检验，致使红花原药材中非法添加的金橙Ⅱ色素被带入到成药中。另外，在日常监督检查过程发现有企业使用樟脑残留不合格的劣质冰片为原料，甚至有以樟脑代替冰片投料的现象。针对心可宁胶囊中这两种非处方成分添加物，本文建立了采用TLC法及HPLC法检查心可宁胶囊中金橙Ⅱ、采用GC法测定心可宁胶囊中樟脑的含量的方法，为制订心可宁胶囊补充检验方法提供依据。

1 仪器和试药

1.1 仪器 WATERS E 2695型高效液相色谱仪；Agilent 7890A型气相色谱仪；Sartorius CP225D电子分析天平；薄层板为硅胶G板[10 cm×20 cm，批号2006323(青岛海洋化工分厂)]。

1.2 试药 对照药材红花(批号120907-200609)、对照试剂金橙Ⅱ(批号111769-200701)、对照品樟脑(批号110747-201008)及冰片(批号110743-200905)均来源于中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈为色谱纯，丙酮、乙醇等为分析醇，水为纯化水。心可宁胶囊样品A～G来源于7个不同的生产厂家，其中样A～样F用于心可宁胶囊中金橙Ⅱ的检测方法研究，样A～样E为金橙Ⅱ阳性样品，样F为金橙Ⅱ阴性正常样品；样B、样C、样F、样G用于心可宁胶囊中樟脑的检测方法研究，其中样B、样C、样G为樟脑阳性样品，样F为樟脑阴性正常样品。

2 实验方法与结果

2.1 心可宁胶囊中金橙Ⅱ的检测方法研究

2.1.1 薄层色谱法 取心可宁胶囊内容物4 g，加80%丙酮溶液10 ml，密塞，振摇15 min，静置，取上清液，作为供试品溶液。取红花对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。另取金橙Ⅱ对照品，加乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验，精密吸取上述溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，金橙Ⅱ阳性样品在与金橙Ⅱ对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。金橙Ⅱ阴性样品在与金橙Ⅱ对照品色谱相应的位置上未显相同颜色的斑点，薄层色谱图见图1。心可宁胶囊样品薄层检查结果图谱见图2。

1.阴性 2.阳性 3.金橙Ⅱ 4.红花

1.样D 2.样B 3.样A 4．金橙Ⅱ 5．样C 6．样E 7．样F

2.1.2 高效液相色谱法

2.1.2.1 色谱条件 色谱柱：Alltech C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流动相：乙腈-0.025 mol/L磷酸二氢钾溶液(含0.2%三乙胺，并用磷酸调pH值为3.0)(40∶60)；流量：1.0 ml/min；检测波长：484 nm；柱温：28 ℃；进样体积：10 μl。

2.1.2.2 对照品溶液的制备 取金橙Ⅱ对照试剂适量，加70%乙醇制成每1 ml约含60 μg的溶液，即得。

2.1.2.3 供试品溶液的制备 取心可宁胶囊内容物约4 g，精密称定，加入70%乙醇20 ml，超声处理20 min，过滤，取续滤液，即得。

2.1.2.4 线性关系考查 取金橙Ⅱ对照品溶液，分别精密吸取对照溶液1、2、3、4和5 ml至10 ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得。取上述溶液按上述色谱条件进行测定，以峰面积(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为A=33 983C-679.7(r=0.999 9)，结果显示金橙Ⅱ浓度在6.75～33.75 μg/ml范围内呈良好线性关系。

2.1.2.5 检测限试验 取浓度为6.75 μg/ml的金橙Ⅱ对照品溶液，分别加70%乙醇稀释成0.081、0.135、0.270和0.675 μg/ml的溶液，取上述溶液各10 μl，进样，记录峰面积，以信噪比为3计，测得金橙Ⅱ的最小检测量为0.81 ng。

2.1.2.6 精密度试验 取同一浓度的对照品溶液，重复进样6次，按上述色谱条件进行测定，其相对保留时间稳定，分别记录峰面积， RSD为0.5%，表明仪器精密度良好。

2.1.2.7 重复性试验 取心可宁胶囊样品(样B)，按样品溶液的制备方法平行制备6份，按上述色谱条件进行测定，分别记录峰面积，并计算其含量，结果金橙Ⅱ平均含量为0.209 9 mg/g，RSD为0.7%，表明该方法重复性良好。

2.1.2.8 加样回收率试验 取已知含量的心可宁胶囊样品(样B)约2 g，共6份，精密称定，精密加入含金橙Ⅱ 0.023 88 mg/ml的对照品溶液20 ml，按样品溶液制备方法制备供试液，依法测定，计算回收率，结果平均回收率为97.52%，RSD为1.3%，表明该方法准确性良好。见表1。

2.1.2.9 耐用性试验 分别考查了柱温、流动相比例及试验仪器三个影响因子，首先考查柱温分别为25、28和30 ℃时的金橙Ⅱ检查结果；另外考查流动相乙腈-0.025 mol/L磷酸二氢钾溶液(含0.2%三乙胺，并用磷酸调pH值为3.0)比例分别为(40∶60)、(35∶65)、(30∶70)时的金橙Ⅱ检查结果；最后考查改变试验仪器WATERS E 2695为Agilent 1200液相色谱仪时的金橙Ⅱ检查结果，多种改变均未对实验结果产生影响，证明本方法耐用性良好。

2.1.2.10 专属性试验 取心可宁胶囊样F(金橙Ⅱ阴性样品)，按“2.1.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定。结果阴性样品HPLC色谱图中在与金橙Ⅱ对照品相同保留时间位置上未出现色谱峰，而心可宁胶囊样A(金橙Ⅱ阳性样品)HPLC色谱图中在与金橙Ⅱ对照品相同保留时间位置上出现相应色谱峰，表明心可宁胶囊中其他药味及辅料等对本方法测定无干扰。

2.1.2.11 测定法 吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μl，分别进样分析，记录色谱图。结果供试品色谱中，在与金橙Ⅱ对照试剂色谱相应的位置上，出现相同的色谱峰，见图3。测定结果见表2。

序号生产厂家测定结果样AA检出金橙Ⅱ样BB检出金橙Ⅱ样CC检出金橙Ⅱ样DD检出金橙Ⅱ样EE检出金橙Ⅱ样FF未检出金橙Ⅱ

2.1.2.12 HPLC-DAD验证 按HPLC法试验，以DAD检测器进行验证，供试品色谱中，与金橙Ⅱ对照试剂色谱相同保留时间的色谱峰的DAD光谱图与金橙Ⅱ对照试剂光谱的谱形、最大吸收波长均一致，心可宁胶囊阳性样A～样E的DAD光谱见图4。

2.1.3 质谱法验证 采用乙腈-0.05 mol/L的醋酸铵溶液(含0.2%醋酸)(35∶65)为流动相；其余色谱条件同高效液相色谱方法。质谱检测参数：离子源为ESI源；负离子模式检测；扫描方式为多反应监测及二级质谱全扫描；扫描范围100～1 000 mz。电喷雾电压：-4 500 V；离子源温度：650 ℃；GS1：30 psi；GS2：30 psi；CUR：30 psi。多反应监测(MRM)离子对：327.0/170.9、327.0/155.9。取心可宁胶囊样A进行测定。供试品与金橙Ⅱ对照试剂色谱相应的位置上，出现相同的选择离子流色谱峰；且供试品与对照品对应色谱峰的分子离子峰相同，质量均为326.9，与金橙Ⅱ的分子离子质量相符。

图4 金橙Ⅱ对照品(A)

2.2 心可宁胶囊中樟脑的检测方法研究

2.2.1 色谱条件 HP-FFAP石英毛细管柱(30 m×0.530 mm×1.0 μm)，柱温140 ℃，进样口180 ℃，FID检测器220 ℃，分流比为3∶1，流速2 ml/min，载气为氮气，进样量1 μl。理论板数按樟脑计不得小于5 000，樟脑对照品及心可宁胶囊各样品在上述色谱条件下的色谱图见图5。

2.2.2 对照品溶液制备 取樟脑对照品24.75 mg，置25 ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，即得。另取冰片对照品适量，加无水乙醇制成每1 ml含0.1 mg的溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 取心可宁胶囊样品10粒，研细，取内容物约0.8 g，精密称定，至锥形瓶中，精密加无水乙醇10 ml，称定重量，超声处理20 min，放冷，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

2.2.4 线性关系考查 取樟脑对照品溶液，分别精密吸取适量，制成系列浓度的对照品溶液。取上述溶液按上述色谱条件进行测定，峰面积(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为A=3.806 4C+2.037 6(r=1)，结果显示樟脑浓度在3.2～980.1 μg/ml范围内呈良好线性关系。

2.2.5 检测限试验 取浓度为10.03 μg/ml的樟脑对照品溶液，分别加无水乙醇稀释成0.100 3、0.160 5和0.200 6 μg/ml的溶液，取上述溶液各1 μl，进样，记录峰面积，以信噪比为3计，测得樟脑的最小检测量为0.1 ng。

2.2.6 精密度试验 取同一浓度的对照品溶液，重复进样6次，按上述色谱条件进行测定，其相对保留时间稳定，分别记录峰面积， RSD为2.4%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一浓度的样品溶液，分别在1、2、3、5 和8 h注入气相色谱仪，记录峰面积，结果樟脑峰面积RSD为3.0%(n=6)，表明样品溶液在8 h内稳定。

1.樟脑

2.2.8 重复性试验 取心可宁胶囊样品(样G)，按样品溶液的制备方法平行制备6份，按上述色谱条件进行测定，分别记录峰面积，并计算其含量，结果樟脑平均含量为0.538 3 mg/g，RSD为1.6%，表明该方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取已知含量的心可宁胶囊样品(样G)约0.4 g，共6份，精密称定，精密加入含樟脑0.025 66 mg/ml的对照品溶液10 ml，按样品溶液制备方法制备供试液，依法测定，计算回收率，结果平均回收率为101.33%，RSD为1.9%，见表3。

表3 心可宁胶囊樟脑回收率试验结果(n=6)

2.2.10 样品测定 取心可宁胶囊样品，分别按“2.2.3”项下的方法制备样品溶液，各取1 μl注入气相色谱仪，依法测定，按外标法计算结果。测定结果见表4。

表4 心可宁胶囊樟脑测定结果

3 讨论

试验中考查了氯仿-甲醇-冰乙酸(7∶ 1∶2)以及乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)两个展开系统，结果两个展开系统中金橙Ⅱ均能很好分离，但是第二个展开系统同时能较好分离红花药材，能够同时检测样品中红花以及金橙Ⅱ的存在情况，故选择第二个展开系统。

金橙Ⅱ(orange Ⅱ)又名酸性橙Ⅱ、橙黄Ⅱ、酸性艳橙、金黄粉、β-萘酚偶氮对苯磺酸钠，是食品禁用色素，其化学结构母核与苏丹红相同，为可疑致癌物质，且有肾脏毒性。近年常发现将其非法添加于红花药材中以达到着色目的[2]。从心可宁胶囊的处方及生产工艺可知，方中含有原粉入药的红花药材。在研究心可宁胶囊红花薄层鉴别时，发现有的厂家样品在Rf值较高于红色素点的位置上出现一个橙黄色斑点，经过研究证实为金橙Ⅱ的斑点，来源考虑为红花药材中非法添加的物质。

《中国药典》2010版一部在冰片项下增加了樟脑检查项，限度为0.50%[3]。心可宁胶囊中检出的樟脑，有的为厂家使用樟脑原料代替冰片非法投料，有的来源于劣质冰片原料中的超量樟脑杂质。

由上可知，金橙Ⅱ及樟脑均为心可宁胶囊中非法添加的非处方成分物质。为有效地控制药品质量，严格打击制假售劣，应加强对心可宁胶囊中金橙Ⅱ及樟脑的检测。本方法专属性高，灵敏度好，可以满足心可宁胶囊中金橙Ⅱ的检测及樟脑限量的检查。

1 闵春艳,付凌燕，汪祺，等.红花药材掺伪染色检测方法的实验研究[J].中国药事，2011，25(8)：772-775

2 饶伟文，蒋玲，赵纯玉，等.几种染色掺假中药的化工染料鉴定[J].药物分析杂志，2007，27(11)：1742-1745

3 中国药典[S].一部.2010：904

Study on determination of illegal additives orange Ⅱ and camphor in Xinkening capsules

Tian Jing，Li Qi，Wen Liyu

(Yangzhou Institute for Drug Control，Yangzhou 225009)

Objective: To establish methods for the determination of illegal additives orange Ⅱ and camphor in Xinkening capsules．Method: The TLC、HPLC and LC-MS/MS methods have been used to determine orangeⅡ and The GC methods have been used to determine camphor in Xinkening capsules．Results: Orange Ⅱ has a good linear relationship(r=0.999 9) at a range of 6.75～33.75 μg/ml．The average recovery was 97.5% and RSD was 1.3%(n=6)．Camphor showed a good linear relationship(r=1) at a range of 3.2～980.1 μg/ml．The average recovery was 101.3% and RSD was 1.9%(n=6)．Conclustion :The methods are simple，accurate，sensitive and repeatable and can be used to determine illegal additives orange Ⅱ and camphor in Xinkening capsules．

Xinkening capsules,orange Ⅱ,camphor,TLC,HPLC,GC

2014-09-21

R927.11

A

1006-5687(2015)01-0001-04