氯喹在抑制癌细胞增殖方面的研究进展

杨 罡，李 劲

(湖北省黄石市中医医院，湖北 黄石 435000)

氯喹在抑制癌细胞增殖方面的研究进展

杨 罡，李 劲

(湖北省黄石市中医医院，湖北 黄石 435000)

氯喹；癌症；自噬；癌细胞增殖

全球癌症发病呈现迅猛增长态势，开发有效的抗癌药物十分迫切，然而开发新的抗癌药需要投入巨大的资金和精力，平均需要花费15年以及几百亿美元的费用，著名药理学家及诺贝尔奖获得者詹姆斯布莱克曾提到过“发现新药的最有效的途径是以现有药物为出发点”[1-2]。解决这个问题的一个途径是发现已有药物的新的功能。氯喹因具有广泛的生理学效应而备受关注，其具有抗炎的功效，从而在疟疾、肠道外阿米巴病、风湿性关节炎及系统性红斑狼疮、自身免疫性肝炎等炎症性疾病中发挥重要的治疗作用。近几年国内外学者研究发现，氯喹可作为放化疗增敏剂提高抗癌疗效，抑制细胞生长、分化并诱导细胞凋亡，特别是其能够抑制自噬的功能在肿瘤治疗中具有重要作用。因为自噬在肿瘤生长过程中的角色会随着疾病的病程变化而不断产生动态变化,与肿瘤的发展密切相关，自噬过程的抑制可以促使蛋白降解减少,合成和代谢过程相对增加,最终导致原癌细胞的持续增殖,癌细胞会通过自吞噬抑制来抵抗肿瘤的恶性环境，例如缺氧、酸性环境和营养缺乏。如果抑制了自噬的保护作用，肿瘤细胞将无法应对代谢压力而死亡，因此氯喹的自噬抑制作用有望为肿瘤治疗提供一种新方法[3-4]。本文将综述近年来关于氯喹自噬抑制在抑制肿瘤细胞生长方面的研究，为癌症治疗的选择提供一个参考。

1 氯喹的发现及性质

在18世纪，最初治疗疟疾的物质是由2位法国化学家从金鸡纳树皮中提取分离出来的，将之称为金鸡纳霜或奎宁，之后奎宁成为抗疟最重要的药物。1934年，德国拜耳制药公司的汉斯·安德柴克博士研制出一个可以代替奎宁的抗疟疾特效药氯喹，它结构简单，是一种4-氨基喹啉类的衍生物。氯喹从1944年开始应用于临床，作为一种价廉、安全而有效的预防和治疗疟原虫感染的药物使用至今。同时它可以通过复杂的抗炎、免疫抑制和免疫调节作用，在临床中发挥抑制关节炎、退热、抗凝、消除皮疹和降血脂等多方面的作用。氯喹化学结构具有一个奎宁环和一个侧链， 氯喹及其衍生物的4位和7位分别有氨基和氯原子,氨基的侧链两个氮原子间均为4个碳，它具有(-)-氯喹和(+)-氯喹两个对映体。氯喹呈弱碱性、味苦，是一种无色二态晶体粉末。在pH 4.5时易溶于水，在中性和碱性条件下难溶于水[5-8]。

2 氯喹的自吞噬抑制作用

近年来的研究发现,自噬作用在肿瘤的发生和发展中起着重要作用,通过对自噬作用的研究，进一步揭示了肿瘤发生和发展的潜在机制，并且为肿瘤的预防和治疗提供了新的思路,是目前国际肿瘤研究中的热点[9-10]。氯喹是一种典型的自噬阻断剂，它属于靶向溶酶体药,因此溶酶体是其浓集的部位。氯喹可以抑制磷脂酶A2、溶血脂酰基水解酶以及单酰基甘油脂肪酶的活性,从而进一步抑制花生四烯酸释放，达到了抑制酸性依赖性的自噬作用,因此自噬体内的物质不能被溶酶体降解，细胞内堆积的自噬性囊泡逐渐增多,导致溶酶体膜的通透性发生改变，直至溶酶体肿胀、破裂而致细胞死亡，通过弱化溶酶体内酸性环境，使溶酶体中的酸性水解酶失活，稳定溶酶体膜，从而导致自噬溶酶体无法发挥作用[11-14]。细胞中溶酶体自吞噬功能与肿瘤具有重要关系，一方面可以为癌细胞的新陈代谢提供能量，尤其是当肿瘤组织内还未形成大量的血管为其扩增提供充足的营养时,自噬作用可以使肿瘤细胞克服营养缺乏和低氧的环境得以生存。如果抑制了自噬的保护作用，减少癌细胞的能量供应,使残余的癌细胞在代谢应激时变得脆弱。在癌细胞中,随着肿瘤恶性程度的增高，无氧代谢的增加,就会导致肿瘤组织pH值比周围正常组织低,并且细胞酸化周围环境能力增强,而氯喹作为一种弱碱性药物,可以选择性进入肿瘤细胞酸性溶酶体，有效抑制肿瘤细胞酸性溶酶体作用而抑制自噬,对pH正常细胞的作用很弱,这也为氯喹更好地作用于肿瘤细胞以及减少正常组织的不良反应打下了良好的微环境基础。此外，一些抗癌药物进入细胞中会被溶酶体吞噬，减弱其作用，而不能发挥作用,因此与氯喹合用可以减少抗癌药的吞噬，使其更好地发挥作用。

3 氯喹的自吞噬抑制作用在胃癌细胞中的研究

氯喹是一种自噬特异性抑制剂，具有提高溶酶体中的pH值,稳定溶酶体膜的功能,它能增强多种化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用[15-16]。氯喹抗癌功效依赖于其可以抑制自吞噬的功能。张慧卿等[17]研究了氯喹促进顺铂诱导胃癌SGC7901细胞凋亡及其机制。在此实验中,合用氯喹组与单用顺铂对照组进行对比,顺铂与胃癌细胞SGC7901作用24 h后，细胞凋亡率为21.07%±2.12%，同时观测到自噬囊泡增多且LC3-Ⅱ蛋白表达升高；顺铂和氯喹合用后细胞凋亡显著增加，氯喹特异性抑制自噬活性提高了顺铂诱导的细胞凋亡率；检测到Bcl-2蛋白表达下降，凋亡相关蛋白P53和Caspase-3表达增加，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低,自噬囊泡明显减少,细胞的增殖和凋亡无明显变化,提示氯喹通过抑制自噬活性促进顺铂诱导细胞凋亡的能力。顺铂作为胃癌化疗的常用药物，在诱导胃癌细胞SGC7901凋亡的同时也诱发了保护性自噬，加入自噬抑制剂氯喹能增强顺铂对胃癌细胞的杀伤作用，提高了化疗敏感性。因此，氯喹和化疗药物的联合应用有望成为胃癌治疗的新策略，值得进一步研究其体内作用和临床疗效。

4 氯喹的自吞噬抑制作用在人结肠癌细胞中的研究

在肿瘤生长过程中，自噬在肿瘤进展中的角色会随着疾病的病程变化而不断产生动态变化,最终会导致原癌细胞的持续增殖,癌细胞会通过自吞噬抑制来抵抗肿瘤的恶性环境，例如酸性环境、缺氧和营养缺乏[18]。氯喹通过抑制溶酶体酸化发挥抑制细胞自噬的作用。有关氯喹的自吞噬作用与肿瘤的关系，研究者在人结肠癌细胞HT-29上进行了试验，研究氯喹与5-氟尿嘧啶(5-Fu)合用或单用5-Fu的抗癌效果[19]。该研究组分别用MTT法测定了细胞的存活率、用流式细胞仪测试了细胞凋亡，此外还用免疫印记技术对细胞的自噬进行了测定。实验结果显示，5-Fu抑制细胞的增殖，主要是依赖于细胞在G0/G1期的凋亡，而此阶段的凋亡是由氯喹诱导的，氯喹使细胞的p21和p27表达增加，而使CDK2得表达减少。此外，由于氯喹是靶向溶酶体药物氯可以抑制细胞自噬, 促进化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。因此，5-Fu与氯喹联合使用，是结肠癌治疗的一种且有广阔前景的治疗方式。王尧等[20]对氯喹联合拓扑替康在各种结肠癌细胞的增殖抑制作用及其可能的机制进行了研究。用MTT法检测了拓扑替康对结肠癌SW620、Colo205、SW480和LoVo细胞的抑制率,同时检测了拓扑替康和氯喹联合作用对LoVo细胞的抑制作用。通过免疫印迹法检测拓扑替康或氯喹作用后的LoVo细胞中，自噬标志蛋白P62、LC3及自噬相关蛋白Beclin1的表达;采用小干扰RNA 沉默Beclin1基因表达后,应用拓扑替康作用LoVo细胞,用锥虫蓝染色法测定细胞死亡率。并且用共聚焦显微镜下观察细胞质内YFP-LC3的点状聚集。实验结果显示，低浓度的氯喹能够增强拓扑替康对LoVo细胞的增殖抑制作用;通过siRNA沉默自噬相关基因Beclin1的表达,也可增强拓扑替康对LoVo细胞的杀伤作用。低浓度氯喹主要通过改变溶酶体膜的通透性或者溶酶体的其他功能来干扰自噬溶酶体，从而阻断拓扑替康诱导的自噬。

5 氯喹的自吞噬抑制作用在人乳腺癌细胞中的研究

现有大量的研究表明，细胞自噬与凋亡是紧密联系的，二者在信号通路上存在交叉[21-22]。研究显示在80%乳腺癌患者中HSF1与Atg7的表达水平呈正相关，这2种表达的物质与乳腺癌患者的生存期缩短及预后不良密切相关。而HSF1/Atg7 在抗肿瘤药诱导的自噬中发挥重要作用，并借此促进肿瘤细胞耐药[23]。张旭东等[24]在人乳腺癌细胞MCF-7中研究了载多西他赛的PEG-PLGA胶束与氯喹合用以后的抗癌效果，以单一的载多西他赛的PEG-PLGA胶束抗癌效果作为对照，将二者的结果进行比较。MCF-7细胞与药物制剂培育24 h之后，实验组和对照组的细胞的半数致死量(IC50)分别为(1.75±0.43)mg/mL和(22.30±1.32)mg/mL,合用氯喹后抗癌疗效提高了12倍。同理，MCF-7细胞与药物分别培育48 h和72 h之后，结果都显示实验组的药物对细胞的抑制作用更强。该课题组进一步研究了制剂在SCID裸鼠体内的抑瘤率，合用氯喹后，药物制剂的抑瘤效果显著增加。为了证明自吞噬抑制剂氯喹在体内能够真正发挥作用，实验者荧光免疫化学组织测定法检测了内源性的LC3蛋白的组织分布，同样在SCID裸鼠体内进行，实验结果显示加有氯喹的实验组自噬小体在细胞内显著积累，说明氯喹阻止了自噬小体与溶酶体的结合。以上的实验结果充分表明，氯喹可以加强抗癌药物多西他赛的抗癌作用。

6 氯喹的自吞噬抑制作用在人肺癌细胞中的研究

研究表明具有凋亡缺陷的肿瘤细胞可以凭借自噬作用减少坏死和炎症反应，以减轻代谢压力下的基因损伤，维持长久生存。但另一方面，自噬作用的缺陷与肿瘤的增长亦相关。对于自噬作用的研究进一步揭示了肿瘤发生、发展的潜在机制，也为肿瘤的治疗和预防提供了新的思路[25]。氯喹不仅发挥直接的抗癌作用，它的自吞噬抑制作用还可增强辐射以及化学治疗对肿瘤的敏感性，这些作用在肺癌的实验中获得证明[26]。实验结果显示，氯喹通过抑制托泊替康诱导的细胞自噬以及激活不依赖于Bcl-2的凋亡，继而增强肺癌A549细胞对托泊替康的敏感性。然而，其机制有待于进一步研究，笔者推测，在A549细胞中托泊替康诱导的自噬抵抗了抗肿瘤药的作用，从而诱导细胞对抗肿瘤药耐受。而氯喹通过抑制促生存的细胞自噬，继而增强肿瘤细胞对抗肿瘤药的敏感性。无独有偶，在小细胞肺癌亦发现了类似的情况[27]。新型抗肿瘤药ABT-737可同时上调小细胞肺癌中自噬与凋亡,与凋亡不同,细胞自噬在此发挥了促进细胞生存的作用。氯喹与ABT-737联用时可下调 Mcl-1以及上调NOXA，继而明显增强肿瘤细胞的凋亡强度，最终使抗肿瘤药的效力加强。与抗肿瘤药相仿，氯喹通过抑制辐射诱导的保护性自噬，增强辐射引发的凋亡，借此增强肺癌细胞细胞对辐射治疗的敏感性。

7 结 语

氯喹是溶酶体靶向剂，可以通过抑制溶酶体酸化而发挥抑制细胞自噬的作用，可作为放化疗増敏剂提高抗癌疗效，抑制细胞生长、分化并诱导细胞凋亡，尤其是其能够抑制自噬的功能在肿瘤治疗中具有重要作用，抑制自吞噬来治疗癌症可以为肿瘤治疗开辟新思路，是抗癌药物研究的一个新方向，并且将能更好地指导氯喹的研究和应用。

[1] Solomon VR,Lee H. Chloroquine and its analogs:a new promise of an old drug for effective and safe cancer therapies[J]. Euro J Pharmacol,2009,625(1):220-233

[2] Rosales-Hernandez MC,Bermudez-Lugo J,Garcia J,et al. Molecular modeling applied to anti-cancer drug development[J]. Anti-Cancer Agents Med Chem,2009,9(2):230-23

[3] Rahim R,Strobl JS. Hydroxychloroquine,chloroquine,and all-trans retinoic acid regulate growth,survival,and histone acetylation in breast cancer cells[J]. Anti-cancer Drugs,2009,20(8):736-745

[4] Munshi A. Chloroquine in glioblastoma-New horizons for an old drug[J]. Cancer,2009,115(11):2380-2383

[5] Amaravadi RK,Lippincott-Schwartz J,Yin XM,et al. Principles and current strategies for targeting autophagy for cancer treatment[J]. Clin Cancer Res,2011,17(4):654-666

[6] Rosenfeldt MT,Ryan KM. The multiple roles of autophagy in cancer[J]. Carcinogenesis,2011,32(7):955-963

[7] Janku F,McConkey DJ,Hong DS,et al. Autophagy as a target for anticancer therapy[J]. Nature Reviews Clin Oncol,2011,8(9):528-539

[8] Sotelo J,Briceno E,López-González MA. Adding chloroquine to conventional treatment for glioblastoma multiforme:A randomized,double-blind,placebo-controlled trial[J]. An Intern Med,2006,144(5):337-343

[9] 韦艳,吴冰. 细胞自噬与肿瘤[J]. 海南医学,2014,25(16):2413-2415

[10] 相建峰,林盛明. 细胞自噬与肿瘤治疗[J]. 中国中西医结合影像学杂志,2012,10(2):174-176

[11] Vander Heiden MG,Cantley LC,Thompson CB. Understanding the Warburg effect:the metabolic requirements of cell proliferation[J]. Science,2009,324(5930):1029-1033

[12] Takamura A,Komatsu M,Hara T,et al. Autophagy-deficient mice develop multiple liver tumors[J]. Genes Development,2011,25(8):795-800

[13] Inami Y,Waguri S,Sakamoto A,et al. Persistent activation of Nrf2 through p62 in hepatocellular carcinoma cells[J]. J Cell Biol,2011,193(2):275-284

[14] Michaud M,Martins I,Sukkurwala AQ,et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice[J]. Science,2011,334(6062):1573-1577

[15] Levy JM,Thorburn A. Targeting autophagy during cancer therapy to improve clinical outcomes[J]. Pharmacol Ther,2011,131(1):130-141

[16] Kimura T,Takabatake Y,Takahashi A,et al. Chloroquine in cancer therapy:a double-edged sword of autophagy[J]. Cancer Res,2013,73(1):3-7

[17] 张慧卿,方念,芦珊,等. 氯喹促进顺铂诱导胃癌SGC7901细胞凋亡及其机制[J]. 中国肿瘤临床,2013,40(16):947-950

[18] 李新,任辉明,赵平,等. 自噬在胰腺癌中作用的研究进展[J/CD]. 中华临床医师杂志：电子版，2013,7(19):8890-8893

[19] Sasaki K,Tsuno NH,Sunami E,et al. Chloroquine potentiates the anti-cancer effect of 5-fluorouracil on colon cancer cells[J]. BMC Cancer,2010,10(1):370

[20] 王尧,李丹丹,朱孝峰,等. 氯喹联合拓扑替康对结肠癌细胞增殖的抑制作用[J]. 肿瘤,2010,30(7):555-560

[21] 张海亮,唐圣松. 细胞自噬与肿瘤耐药[J]. 中国生物化学与分子生物学报,2014,30(3):224-232

[22] Santagata S,Hu R,Lin NU,et al. High levels of nuclear heat-shock factor 1 (HSF1) are associated with poor prognosis in breast cancer[J]. Proceed National Acad Sci,2011,108(45):18378-18383

[23] 罗韬. Gankyrin调控自噬及其在肝癌进展中的作用及机制研究[D]. 上海：第二军医大学，2014

[24] Zhang X,Zeng X,Liang X,et al. The chemotherapeutic potential of PEG-b-PLGA copolymer micelles that combine chloroquine as autophagy inhibitor and docetaxel as an anti-cancer drug[J]. Biomaterials,2014,35(33):9144-9154

[25] 刘溶,翟清波,张伟东,等. 细胞自噬与肿瘤治疗[J]. 药学进展,2010,34(5):210-214

[26] Wang Y,Peng RQ,Li DD,et al. Chloroquine enhances the cytotoxicity of topotecan by inhibiting autophagy in lung cancer cells[J]. Chinese J Cancer,2011,30(10):690

[27] Zinn RL,Gardner EE,Dobromilskaya I,et al. Combination treatment with ABT-737 and chloroquine in preclinical models of small cell lung cancer[J]. Molecular Cancer,2013,12(1):16

2013年度山东省科学技术厅医学基金项目(SDKJ201344410)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.24.045

R979.1

A

1008-8849(2015)24-2734-03

2015-01-15