前列腺癌干细胞的研究进展

王蕾 郑新民

在西方国家，前列腺癌（prostate cancer，PCa）是影响男性健康最常见的恶性肿瘤之一。最新的统计资料显示，预计在2014年，PCa将占到男性新发病例的首位（27%，233 000例）及 死 亡 率 的 第 二 位 （10%，29 480 例）［1］。 目 前，PCa发生、发展的病因学以及其向雄激素非依赖阶段进展的分子机制尚不完全清楚。许多实体肿瘤研究系统显示出的证据表明恶性肿瘤中存在一类特殊的亚群，即类干细胞样癌细胞，被称为肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）。CSCs假说认为一个单一的类干细胞样癌细胞能够产生出肿瘤中所有表型的癌细胞，因此它可能是肿瘤发生、进展、远处转移和治疗抵抗的根源并导致了肿瘤细胞的异质性。肿瘤细胞的异质性可以用两种模型来解释，即克隆演变（随机）模型和CSCs（分层）模型，这两种模型可能并不是相互独立的。克隆演变随机模型假说认为，在一些癌细胞中遗传学和表观遗传学的改变赋予占主导地位的克隆以生存优势，并且所有肿瘤细胞中的克隆具有相似的肿瘤起始能力［2-4］。与克隆演变随机模型不同，CSCs理论提出许多人类肿瘤的癌细胞在组织学上是分层的，只有极少数的细胞处于“干性层次树”的顶部并启动肿瘤的发生、驱动肿瘤的发展，为肿瘤起始细胞。这些肿瘤起始细胞拥有与正常干细胞相同的细胞表型和相关的功能特性，故被称为CSCs。尽管PCa的诊断及治疗取得了明显的进步，但目前仍有几个主要的临床疑问困惑着我们，如无法精准地从活跃的PCa细胞中分离出惰性细胞；对于激素难治性PCa尚缺乏有效的治疗手段；PCa定向骨转移的机制尚不完全清楚。因此，更好地研究PCa进展过程中潜在的分子机制将带来新的诊断工具和新的治疗策略。近年来，越来越多的证据显示PCa干细胞在PCa的发生、发展及转移中扮演着重要的角色。因此，靶向PCa干细胞的治疗将成为PCa治疗的一个新策略，这将使PCa患者获得更好的生存。

一、干细胞与CSCs

1.干细胞：干细胞是特指一类具有无限自我更新能力的多潜能细胞，并能产生出至少一种高度分化的子代细胞。根据干细胞的发生学来源可将其分为胚胎干细胞和成体干细胞，二者均具有多向分化潜能、永生性及无限的自我更新能力的特点。多向分化潜能和自我更新能力取决于一些转录因子，例如Oct-4、Sox2和 Nanog［5-6］。目前认为每种器官的成体干细胞均可通过重构分化成各器官的成熟（或分化）的细胞类型。成体干细胞被认为存在于一种特殊的微环境，即干细胞“壁龛”，并在正常组织的再生和修复过程中发挥着关键作用。研究发现调控正常干细胞自我更新的一些信号通路的失控往往导致人类癌症，例如 Wnt／β-catein、Notch、Hedgehog和 TGF-β信号通路［7］。

2.CSCs：1855年，Rudolph Virchow最先暗指了 CSCs的存在，他观察到肿瘤与胚胎组织具有组织学上的相似性，并将其命名为“胚停留假说”。当前干细胞研究被广泛地应用于造血系统疾病。CSCs假说始于对白血病的研究，1994年，CSCs首次从白血病患者身上分离提纯出来［8］。2001年Reya等［9］通过对急性髓性白血病的研究，强有力地证明了CSCs分层模型，在总结前人研究成果的基础上首次提出了CSCs假说，认为一小群未分化并具有强大的自我更新能力的癌细胞导致了肿瘤的发生及持续生长。它们是存在于肿瘤内的极少数细胞，是“肿瘤的种子”，是驱动肿瘤形成和生长、保持肿瘤异质性并促进肿瘤无限增殖、复发和转移的根源，也是化疗和放疗抵抗的重要原因之一。最初支持CSCs理论的证据源于一系列的移植实验，这些实验表明癌细胞是由一群异质性的细胞组成，它们具有不同的表型和自我更新能力。近十余年来，通过特定的分子标记，假定的CSCs或肿瘤起始细胞在许多实体肿瘤中被鉴定出来，其中包括乳腺癌［10］、脑胶质细胞瘤［11］、胰 腺 癌［12］、肺癌［13］、卵 巢 癌［14］、皮肤黑色素瘤［15］、PCa［16］、结肠癌［17］及头颈部肿瘤［18］等，进一步证实了CSCs假说。CSCs被认为是起源于正常器官的成体干细胞，具有一些与干细胞共有的特性，包括：①均具有无限增殖和分化的潜能；②具有相似的调节自我更新的信号传导途径；③具有不同的表型和异质性；④端粒酶活性；⑤相似的归巢和转移的途径。此外均能诱导血管生成及抵抗凋亡等特点。这些共同点提示CSCs可能来源于成体干细胞。同时CSCs也被认为是肿瘤根治性治疗失败的原因［9］。因此，研究CSCs的生物学特性将极大地有利于临床治疗。目前积累的实验证据和临床证据均支持这一假说，即认为肿瘤细胞中含有一种罕见的具有干细胞特性的亚群细胞，能够自我更新并导致肿瘤细胞团的增殖和分化具有层次性。正是这一亚群细胞导致了肿瘤的发生、发展、复发以及远处脏器的转移。

CSCs的两个重要特性是自我更新和分化潜能。研究癌细胞是否具有无限的自我更新能力最严格的方法是将之移植入非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷（non-obese diabetes-SCID mice，NOD／SCID）小鼠。分析CSCs的分化能力最常用的方法是检测其细胞表面分子标记的改变。关于CSCs的鉴定，在传统的体外评估中，CSCs的鉴定主要是利用低粘附环境的“球形成”培养，而体内评估则是通过其细胞表面特殊的分子标记，利用荧光激活的流式细胞分选术将之分选并连续移植于免疫缺陷的动物模型以检测它们的致瘤能力。随之所形成的一系列的移植瘤均应该包含异质性的细胞表型和CSCs，因其具有自我更新和分化的潜能。然而，目前使用的免疫缺陷的动物模型是有缺点的，它并不能真实地反映CSCs在人体微环境下的生物学特性。

尽管在不同的实体肿瘤中，CSCs的分子标记是明显多样化的，但一些恶性肿瘤却拥有相同的CSCs标记。例如CD133（prominin 1），一种主要在胚胎上皮结构的5次跨膜糖蛋白，已经在一些实体肿瘤中被发现为重要的CSCs表面标记，包括脑肿瘤、PCa、肝细胞癌、卵巢癌、结直肠癌和肺癌。有趣的是，CD133在小细胞肺癌中是一个暂时性的CSCs标记，而在非小细胞肺癌中却不是。同样，CD44也被认为是多种实体肿瘤CSCs的标记，包括乳腺癌、结肠癌［19］、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌［18］和 PCa［20］。

二、前列腺干细胞与PCa干细胞

1.前列腺干细胞：前列腺上皮细胞在结构上和功能上都是一个复杂的组织，由双层上皮细胞构成腺体结构，并由多种不同的细胞类型组成，包括基底细胞、腺上皮细胞和神经内分泌细胞。除此以外，还有一小群特殊类型的细胞，呈未分化状态，具有自我更新能力和分化潜能，因此被称为“干细胞”。腺上皮细胞是构成腺体的主要细胞，其细胞表达细胞角蛋白8和18（CK8、CK18）、雄激素受体（androgen receptor，AR）、PSA和前列腺酸性磷酸酶（prostatic acid phosphatase，PAP）。基底细胞在前列腺上皮细胞总数中的含量不足10%，其细胞表达细胞角蛋白5和14（CK5、CK14）、P63和CD44，不表达PAP和PSA。

成人的前列腺是一个生长相对缓慢的组织，并且其细胞的增殖和凋亡也十分有限，因此人们关于成人前列腺干细胞是否存在争议了很多年。在哺乳动物的正常前列腺中存在干细胞的最早证据是基于鼠科实验，该实验证实成年鼠的前列腺可以经历重复多次的阉割引起的萎缩和雄激素所致的再生。因为雄激素的消退并不能影响基底细胞，所以人们推测有一种具有类似干细胞特性的细胞存在于基底层，不需要雄激素的刺激便可导致前列腺的生长。这一假设得到了许多研究结果的支持。这些研究结果表明，不仅前列腺组织的生成及发育需要P63基因的表达（一种基底细胞的分子标记），而且管腔分泌细胞也是由表达P63基因的基底细胞分化而来［21］。前列腺干细胞在基质中一种特殊的壁龛周围，通过旁分泌来维持干细胞的存活和组织再生。然而，Kurita等［22］在组织再生及移植实验中观察到小鼠P63-的泌尿生殖窦的胚胎间充质细胞可以再生前列腺导管上皮，这表明在前列腺中存在较P63＋更原始的细胞并由之产生出腺上皮细胞。目前关于正常的成体前列腺干细胞的起源及发展仍存在争议，一些学者认为存在一种基底细胞和腺上皮细胞共同的祖细胞，由基底细胞分化出腺上皮细胞。另一些学者则认为基底细胞和腺上皮细胞拥有各自的祖细胞以维持它们自身的生长［23］。

在成人前列腺中，曾有数个分子标记被认为可能是前列腺干细胞的标记。后来在体外实验的研究中发现基底细胞中存在前列腺干细胞，表达CK5＋、CK14＋、CD133＋、CD44＋并且高表达整联蛋白β1［23］。这类细胞仅占前列腺基底上皮细胞的1%，并从基底细胞层分化成腺上皮细胞。尤其是表达CD44、整联蛋白α2β1和CD133分子的前列腺上皮细胞，能够分化成前列腺正常形态的细胞并具有高增殖能力。Collins等［16］利用前列腺干细胞标记（CD44＋、α2β1hi、CD133＋）从人前列腺切除术的标本中分离出假定的前列腺干细胞，这些细胞不表达AR，但将它们置于含有血清和二氢睾丸酮的培养环境时，它们便呈现出更多的腺上皮表型，表达AR、CK18和PAP。尽管这一研究并没有将这些假定的前列腺干细胞移植入NOD／SCID鼠模型进行体内研究，但他们提供了可靠的体外实验数据证实 CD44＋／α2β1hi／CD133＋的细胞具有前列腺干细胞的特性，与对照组相比具有更强的穿透Matrigel基质胶的能力。然而，近期 Missol-Kolka等［24］的研究报道CD133在人前列腺的表达并不仅仅在少数的基底干细胞和祖细胞，还表达于一些腺上皮分泌细胞。此外，他们还发现CD133在PCa组织中下调而在癌旁组织的腺上皮细胞中上调。与人前列腺中CD133的表达不同，鼠前列腺组织中CD133表达十分广泛。还有几个其他的分子标记被用于前列腺干细胞的研究，如醛脱氢酶（ALDH）、肿瘤相关钙信号传感器2（Trop2）、三磷酸腺苷结合转运体G2（ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2）、P63等均被报道用于人和鼠的前列腺干细胞的分离和鉴定［25］。此外，Trop2＋CD44＋CD49f＋的基底干细胞被证实具有更强的前列腺球形成能力和组织再生能力［26］。

2.PCa干细胞：CSCs被定义为具有无限的自我更新能力、高增殖能力及致瘤性。鉴定CSCs的“金标准”是能够在免疫缺陷的老鼠体内形成组织学上与亲代相似的可连续移植的肿瘤［27］。绝大多数的CSCs的实验研究方法都取决于正常干细胞的富集方法，如利用细胞表面的分子标记采用流式细胞分选（fluorescence-activated cell sorting，FACS）、免疫磁珠分选（magnetic activated cell sorting，MACS）或通过侧群细胞（side population，SP）达到富集分选的目的。PCa干细胞被认为是PCa发生、发展、复发及远处转移的根源。目前已有一些研究明确了PCa干细胞的存在［28-29］。例如，Collins等［16］发现CD44＋／α2β1hi／CD133＋的人PCa细胞具有强的克隆形成能力并具备CSCs特有的潜能。在长期培养的PCa细胞系（如DU145）中，CD44＋的PCa细胞优先表达“干性”基因并大多数处于静止状态，并且与分离纯化的CD44-细胞相比具有更强的致瘤能力和转移能力。随后的研究显示，CD44＋α2β1hi的PCa细胞在LAPC9模型中进一步富集了PCa干细胞。另有一些研究通过不同的分子标记研究了PCa干细胞，这些分子标记有CD133、CXCR4和TRA-1-60／CD151／CD166［30］。不依赖分子标记也能富集PCa干细胞，例如在LAPC9模型中SP细胞的致瘤性10倍于非SP细胞［31］；ALDH＋的PCa细胞表现出高的致瘤性和强的转移能力［32］。PSA-／low的PCa细胞与PSA＋的细胞相比表现出更多的干细胞特征：①PSA-／low的PCa细胞有更强的克隆形成能力及球形成能力；②PSA-／low的PCa细胞更多地处于细胞静止期；③PSA-／low的PCa细胞过表达许多干细胞相关的基因，如 Nanog、CD44、SPP1等；④PSA-／low的PCa细胞对于去势治疗及化疗（如紫杉醇）具有更强的抵抗性；⑤PSA-／low的PCa细胞所形成的连续移植瘤在组织学上与亲代肿瘤相似；⑥PSA-／low的PCa细胞可以通过不对称分裂来完成自我更新并产生PSA＋的细胞。重要的是，PSA-／low的PCa细胞亚群依然是异质性的，真正的具有对去势治疗抵抗的PCa干细胞只是其中的小部分细胞。为了支持这一猜想，有研究从PSA-／low的PCa细胞中分离出 ALDH＋CD44＋α2β1hi的亚群细胞，并证明这些细胞能够在完全阉割的老鼠身上形成连续性的移植瘤。

近年来，越来越多的证据表明，一些分子和信号通路参与了PCa干细胞活性的调节。例如Nanog，一种同源转录因子，在调节胚胎干细胞的多能性中起着决定性的作用。在PCa干细胞的活性和致瘤能力上也起着重要的作用。在CD44＋的PCa细胞中Nanog的表达增强，而沉默Nanog基因可抑制肿瘤增殖。miR-34a在CD44＋PCa细胞中起负性调节作用，随之的实验证实miR-34a对于CD44＋PCa细胞的负性调控作用强大，通过靶向CD44＋PCa细胞而达到抑制PCa干细胞的致瘤能力和转移能力［33］。最近的一些研究表明，Trop2在正常前列腺干细胞的自我更新能力的调节中起着重要的作用，这说明Trop2可能不仅是分子表型标记，而且从机能上影响前列腺干细胞和PCa干细胞的活性［34］。

三、PCa干细胞的分子标记及富集、分选方法

PCa干细胞仅是PCa细胞中一小类亚群细胞，可以在体外形成大的克隆并在免疫缺陷动物体内形成移植瘤。因为PCa干细胞的自我更新能力及持续生长能力导致了PCa的复发、远处转移及治疗失败。目前学者们致力于研究如何将这群特殊的细胞分离并研究它们的特性，以期更好地研发出针对它们的靶向治疗。

大量的学者围绕CSCs理论展开了激烈的辩论。从PCa细胞系和PCa患者瘤体分离出的PCa干细胞在细胞表型上有明显的异质性，这种异质性使得PCa干细胞表面标记的鉴定变得复杂，并且阻碍了针对其特异性的靶向治疗的研究。关于PCa细胞的起源我们知之甚少，有证据表明不论在人体还是老鼠模型中，PCa既可能来源于基底细胞也可能来源于腺上皮细胞［35］。同样，干细胞转化为CSCs的具体机制也不清楚。因此弄清楚PCa干细胞的表型及其生物学特性对研究PCa干细胞是十分重要的。

研究PCa干细胞的分子标记将为我们分离纯化PCa干细胞并研究其特性提供帮助。分子标记利于我们从细胞系或原发肿瘤中分离PCa干细胞。CD44是一种透明质酸结合的细胞膜表面糖蛋白，近来常被用来在许多组织中分选可能的CSCs，包括PCa。当用于PCa干细胞的研究时，CD44常常需要和其他的分子标记联合使用。有研究表明从四种不同的PCa细胞系中获得的“前列腺球”均高表达CD44。由DU145的“前列腺球”中纯化的CD44＋／CD24-的细胞具有分化潜 能［36］。Collins等［16］发 现 CD44＋／α2β1hi／CD133＋的人PCa干细胞在患者前列腺肿瘤活组织内的含量仅占0.1%。免疫荧光检测法被用于从DU145细胞球中检测一些可能的PCa干细胞分子标记，如CD44、CD24和α2β1hi整联蛋白。在这一研究中使用的标记是 CD44＋／CD24＋／α2β1hi，而非CD44＋／CD24-。这提示在恶性肿瘤细胞中可能不止一种类干细胞样的细胞存在，并且在分离PCa干细胞中单一的抗原是不够的。ABC转运体超家族中的ABCG2在多种肿瘤中被用作为鉴定CSCs的分子标记。ABCG2可能与CSCs化疗耐药有关。但其作为CSCs的分子标记仍有争议，可以用其来鉴定治疗抵抗的亚群细胞。近来，ABCG2联合其他的分子标记被用来从人体PCa组织中鉴定PCa干细胞，如CD133＋／CD44＋／ABCG2／CD24-。目前知道一些决定胚胎干细胞的多能性的基因如Nanog、Oct-4和Sox2在成体干细胞和CSCs中均有表达，DU145细胞所形成的“前列腺球”中就表达上述基因。研究表明，从人PCa组织中获得的原代细胞中表达Nanog和Oct-4者预后差，在异种移植瘤实验中，少量CD44＋的PCa干细胞样细胞中也发现有Nanog的表达［37］。

目前从人体前列腺肿瘤组织或PCa细胞系成功富集分离获得PCa干细胞的途径主要有三种：①SP法，能够主动地将荧光染料Hoechst33342排出细胞外，再通过流式细胞术将其分选出来。这一方法的劣势是Hoechst染料具有细胞毒性，所选细胞可能不适合做进一步的实验；②通过细胞膜表面特殊的分子标记，用相对应的抗体与之结合，再通过FACS和／或MACS将其分选出来；③CSCs可在添加了特殊生长因子的无血清培养基中形成悬浮球状生长并得到富集。

四、PCa干细胞与治疗抵抗

有学者通过选择对标准抗癌治疗抵抗的细胞而成功分离CSCs，这是基于一些研究中观察到CSCs可在暴露于化疗药物的环境中生存。同样，PCa干细胞被观察到能够抵抗放射治疗和去势治疗［38］。如果PCa中存在PCa干细胞，那么它就可能从多种治疗中逃逸并最终导致肿瘤复发、进展及转移。这一激动人心的治疗新靶标值得我们进一步的分析及研究。下面从PCa干细胞治疗抵抗的多个方面来阐述。

1.PCa干细胞与化疗抵抗：通过SP细胞来分选CSCs是常用的方法之一，它利用荧光染料Hoechst33342将活细胞染色，而类干细胞样的细胞可将这种荧光染料排出细胞外，因此便可通过流式细胞仪将这群不被染色的细胞分选出来。这种能将Hoechst染料排出细胞外的能力源于其表达ABC转运蛋白，即ABCG2，它也能将化学治疗的药物排出细胞外。借助这一原理，当我们无法确定CSCs的细胞表型时可通过化疗耐药的细胞来寻找并鉴定CSCs。Liu等［33］从PCa 22Rv1细胞系中分选出了CD117＋／ABCG2＋PCa干细胞，同时表达干细胞标记物如Nanog、Oct-4、Sox2、巢蛋白以及CD133，对顺铂、紫杉醇、阿霉素及甲氨蝶呤等多种化疗药物耐药。进一步研究证实ABCG2启动子CpG岛的甲基化水平降低可能是CD117＋／ABCG2＋PCa干细胞化疗耐药的重要原因。

在一些细胞培养实验中，直接将癌细胞暴露于化疗药物（如多西紫杉醇）中以此获得化疗耐药细胞。Domingo等［29］采用体外和体内试验，分选出一部分对多西紫杉醇耐药的PCa细胞，这部分细胞具有CSCs特性，高表达Notch和Hedgehog信号，靶向Notch和Hedgehog信号通路能通过抑制AKT和Bcl-2清除这部分对多西紫杉醇耐药的细胞，提示Notch和Hedgehog信号通路的高表达可能是PCa干细胞化疗耐药的重要原因。

2.PCa干细胞与放疗抵抗：一些被分离出的CSCs显示出对放射治疗的抵抗。目前已经发现乳腺癌干细胞和恶性脑胶质瘤的干细胞对放射治疗抵抗［39］。目前，在PCa干细胞的特性中尚未明确其是否放射抵抗。在两种PCa细胞系的研究中发现它们对放射治疗的反应是不同的［38］。LNCaP中的CSCs与亲代细胞相比在经过放疗后表现为存活细胞数量增加，而DU145中的CSCs与亲代细胞相比则无变化。这些研究表明PCa干细胞对放射治疗抵抗的具体机制是不明确的，因此需要更多的研究以明确放射抵抗是否为PCa干细胞的一个明显特征［40］。

3.PCa干细胞与激素难治性PCa：雄激素和AR对于前列腺的发育及PCa都是至关重要的。雄激素剥夺治疗是治疗进展期PCa的常用方法，大多数的肿瘤细胞会死亡或缓解。然而，经过一段时间后大部分患者会进展为激素难治性PCa（hormone-refractory prostate cancer，HRPC）并导致复发及转移。HRPC的病因学目前仍不完全清楚。Miki等［38］研究发现将AR-的干细胞样PCa细胞球培养于可诱导分化的环境时，细胞可转化为AR＋。有研究表明缺乏AR可能是PCa干细胞的一个重要特性，CD133＋PCa细胞为AR-，从人PCa细胞系中获得的CD44＋细胞也是AR-［38］。因此检测雄激素抵抗和AR的表达对于鉴定PCa干细胞是非常重要的，而研究PCa干细胞将有助于解释HRPC进展中尚不明确的机制。

五、展望

CSCs这一概念受到越来越多的学者的关注和肯定，目前已在多种实体瘤中得到证实，包括PCa。阐明PCa干细胞的表型、功能特性及其分子调节系统将有助于我们更好地认识PCa的发生、发展及转移的机制。目前尚有许多疑惑困扰着大家，如PCa干细胞众多不同的分子表型之间的联系；PCa干细胞耐受化疗及放疗的具体机制；PCa干细胞生长的微环境等等。这些均需要深入的研究，以期寻找到针对PCa干细胞的特异性靶向治疗药物及方法，使PCa患者受益。

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