姜黄素对人早幼粒白血病细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

孟腾腾，魏 虹，管东方，吴广胜，张志威，齐新宇



·论著·

姜黄素对人早幼粒白血病细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

孟腾腾，魏 虹，管东方，吴广胜，张志威，齐新宇

目的 研究姜黄素对人早幼粒白血病细胞HL-60细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法 将HL-60细胞设立实验组、阴性对照组、空白对照组，实验组分姜黄素(0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L)单独亚组和姜黄素(0、5.0、10.0、20.0 μmol/L+30 μmol/L GANT61)联合亚组，于作用24、48 h时观察。采用CCK-8法检测HL-60细胞增殖，计算细胞增殖抑制率；并评价体外联合应用药物对细胞毒性作用是否有协同作用；采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测细胞凋亡率。结果 姜黄素单独亚组和姜黄素联合亚组在24、48 h对HL-60细胞的抑制率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；培养至24、48 h时，5.0、10.0、20.0 μmol/L姜黄素联合亚组分别与5.0、10.0、20.0 μmol/L单独亚组对HL-60增殖抑制率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；培养至24、48 h时，10.0、20.0 μmol/L姜黄素联合亚组与0 μmol/L姜黄素联合亚组对HL-60增殖抑制率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。培养至24 h时，5.0 μmol/L姜黄素与30 μmol/L GANT61对HL-60细胞的增殖抑制率呈拮抗作用，培养至48 h时，呈单纯相加作用；24、48 h时，10.0、20.0 μmol/L姜黄素与30 μmol/L GANT61联合用药对HL-60细胞的增殖抑制率均呈增强作用。培养至24、48 h时，姜黄素、GANT61和姜黄素+GANT61对HL-60细胞凋亡率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中，培养至24 h时，10.0、20.0 μmol/L姜黄素联合用药分别与10.0、20.0 μmol/L姜黄素单独用药对HL-60细胞凋亡率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；培养至48 h时，5.0、10.0、20.0 μmol/L姜黄素联合用药分别与5.0、10.0、20.0 μmol/L姜黄素单独用药对HL-60细胞凋亡率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；5.0、10.0、20.0 μmol/L姜黄素联合用药与GANT61单独用药对HL-60细胞凋亡率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 姜黄素和GANT61联合用药对HL-60细胞增殖具有协同抑制作用，显著促进HL-60细胞凋亡，而且与浓度和时间有关，姜黄素可能通过抑制Hedgehog信号通路而起作用。

白血病，髓样，急性；姜黄素；GANT61；Hedgehog-Gli信号通路

姜黄素(curcumin)是一种从姜黄根茎中提取的天然化合物，具有抗氧化[1]、抗感染[2]、抗动脉粥样硬化[3]、抗纤维化[4]、神经保护[5]、抗肿瘤[6-7]等作用。姜黄素对人早幼粒白血病细胞HL-60细胞生长有抑制作用，并诱导细胞凋亡[8]。Hedgehog(Hh)信号通路异常活化参与多种肿瘤形成，如皮肤基底细胞癌、小脑成神经管细胞瘤、横纹肌肉瘤、胰腺癌、结肠癌、胃癌、肺癌、前列腺癌[9]。GANT61是特异性抑制Gli转录的Hh-Gli信号通路抑制剂，其可以抑制薯蓣皂苷元(diosgenin)介导的HEL细胞中巨核细胞分化[10]，抑制卵巢癌细胞的侵袭和迁移[11]，抑制非小细胞型肺癌上皮间质转化[12]，抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡[13-14]。姜黄素通过抑制Hh信号通路进而抑制胶质瘤细胞增殖及细胞集落形成，并显示出浓度和时间依赖性[7]。本实验在体外研究姜黄素单独及与GANT61联合用药对HL-60细胞增殖、凋亡的影响，为今后白血病临床用药提供部分实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂 GANT61为Selleck公司产品；姜黄素(纯度≥94%)购于Sigma公司；RPMI 1640培养基和胎牛血清为Gibco公司产品；Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)购自日本同仁化学研究所(Dojindo)；AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 细胞株及培养条件 HL-60细胞购自中国科学院细胞库。细胞培养采用含10%胎牛血清，1×105U/L青霉素，含1×105U/L链霉素的RPMI 1640培养液，在37 ℃，5% CO2饱和湿度培养箱中培养，每48 h换液传代1次。取生长良好，细胞活性>95%的细胞进行实验。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8实验分组 将HL-60细胞设立实验组、阴性对照组、空白对照组，每组设5个复孔，实验组分姜黄素(0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L)单独亚组和姜黄素(5.0、10.0、20.0 μmol/L)、GANT61(30 μmol/L)联合亚组，阴性对照组为完全培养基+DMSO+HL-60细胞，空白对照组为完全培养基+DMSO，分别作用24、48 h。

1.3.2 CCK-8法检测细胞增殖 取对数生长期HL-60细胞，调整细胞密度，按4.5×104/孔接种细胞于96孔板中，24 h后加入上述不同浓度的药物，放入培养箱中孵育到上述各相应时间，每孔加入10 μl CCK-8溶液作用2 h，用酶标仪测450 nm处各孔的吸光度(OD)值，最后按以下公式计算各实验组抑制率，抑制率(%)=〔1-(实验组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)〕×100%。

1.3.3 协同作用 评价体外联合应用药物对细胞毒性作用是否有协同作用，参照公式判断：Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)，其中Ea+b为联合用药抑制率，Ea和Eb分别为a药和b药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”，分母是“期望合并效应”。Q值0.86～1.15为单纯相加(+)，Q值1.16～2.00为增强(++)，Q值0.55～0.85为拮抗(-)，Q值<0.55为明显拮抗(--)。

1.3.4 AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测细胞凋亡率 收集对数生长期HL-60细胞，调整细胞浓度为3×108/L，培养24 h后，分别单独加入姜黄素(0、5.0、10.0、20.0 μmol/L)、GANT61(30 μmol/L)和姜黄素(5.0、10.0、20.0 μmol/L)、GANT61(30 μmol/L)联合应用，每个浓度均设3个复孔，分别作用24、48 h后，收获培养细胞，用冷PBS洗涤2次，离心去上清液。用Annexin结合液重悬细胞，调整细胞浓度为1×109/L，向细胞悬液加5 μl AnnexinⅤ-FITC混匀，4 ℃避光孵育15 min，加入10 μl PI，4 ℃避光孵育5 min，上流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 实验组对HL-60细胞的增殖抑制效应 姜黄素单独亚组和姜黄素联合亚组在24、48h对HL-60细胞的抑制率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中其他各浓度与0μmol/L姜黄素单独亚组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；培养至24、48h时，5.0、10.0、20.0μmol/L姜黄素联合亚组分别与5.0、10.0、20.0μmol/LHL-60增殖抑制率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；培养至24、48h时，10.0、20.0μmol/L姜黄素联合亚组与0μmol/L姜黄素联合亚组对HL-60增殖抑制率比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table 1 Comparison of proliferation inhibition rate of HL-60 cells between curcumin single subgroups and curcumin combined subgroups

组别浓度(μmol/L)抑制率(%)24h 48h姜黄素单独亚组0-1893±2184-2396±2366254127±2589a6495±0849a505000±1737a14340±2477a10012420±3291a32943±4172a20040997±1733a74890±6311a40057197±6202a806633±1489a姜黄素联合亚组0+3023437±3187a28290±1960a50+3017333±2440ab37783±1558ab100+3040380±1289abc65543±2431abc200+3082693±2651abc98207±0548abcF值2606290214P值<0001<0001

注：与0 μmol/L姜黄素单独亚组比较，aP<0.05；与同一浓度水平姜黄素单独亚组比较，bP<0.05；与0 μmol/L姜黄素联合亚组比较，cP<0.05

2.2 协同作用 培养至24 h时，5.0 μmol/L姜黄素与30 μmol/L GANT61对HL-60细胞的增殖抑制率呈拮抗作用，10.0、20.0 μmol/L姜黄素与30 μmol/L GANT61联合用药对HL-60细胞的增殖抑制率呈增强作用；培养至48 h时，5.0 μmol/L姜黄素与30 μmol/L GANT61对HL-60细胞的增殖抑制率呈单纯相加作用，10.0、20.0 μmol/L姜黄素与30 μmol/L GANT61对HL-60细胞的增殖抑制率呈增强作用(见表2)。

表2 姜黄素联合GANT61对HL-60细胞协同抗肿瘤作用

Table 2 Synergistic antitumor effect of the simultaneous administration of curcumin and GANT61 on HL-60 cells

姜黄素联合GANT61(μmol/L)Q值24h 48h50+30065098100+30133126200+30151120

2.3 姜黄素和GANT61对HL-60细胞凋亡率的影响 培养至24、48 h时，姜黄素、GANT61和姜黄素+GANT61对HL-60细胞凋亡率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中，培养至24 h时，20.0 μmol/L姜黄素单独用药及5.0 μmol/L、10.0 μmol/L、20.0 μmol/L姜黄素联合用药对HL-60细胞凋亡率与0 μmol/L姜黄素单独用药比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；10.0、20.0 μmol/L姜黄素联合用药分别与10.0、20.0 μmol/L姜黄素单独用药对HL-60细胞凋亡率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；培养至48 h时，其他各浓度用药与0 μmol/L姜黄素单独用药对HL-60细胞凋亡率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；5.0、10.0、20.0 μmol/L姜黄素联合用药分别与5.0、10.0、20.0 μmol/L姜黄素单独用药对HL-60细胞凋亡率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；5.0、10.0、20.0 μmol/L姜黄素联合用药与GANT61单独用药对HL-60细胞凋亡率比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表3)。

3 讨论

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，虽然当前诱导治疗完全缓解率近80%，但60%以上最终耐药复发[15]，5年总生存率不到40%。因此，研发新的化疗药物及新的联合用药方案尤其是敏感有效、毒副作用小且经济适用的化疗方案成为当今研究的热点。

姜黄素是姜黄的主要组成部分，通常被用于香料和食品着色剂，来源广泛、价格低廉且每天应用剂量高达10 g对人体无不良反应，可通过多种不同途径发挥良好的抗肿瘤作用，目前，已有临床试验应用姜黄素治疗胰腺癌，多发性骨髓瘤和结肠直肠癌[16-17]。

Table 3 Comparison of apoptosis rate of HL-60 cells between the single application of curcumin，GANT61 and the combined application of them

组别浓度(μmol/L)凋亡率(%)24h 48h姜黄素单独用药04153±15113413±1050505497±11309787±0653a1006340±124813853±1665a20019270±1784a34187±1978aGANT61单独用药307543±128916443±0537a姜黄素+GANT61联合用药50+308710±1192a27353±0491abc100+3017000±4403abc36177±1662abc200+3040696±2143abc39643±1446abcF值10672790979P值<0001<0001

注：与0 μmol/L姜黄素单独用药比较，aP<0.05；与同一浓度水平姜黄素单独用药比较，bP<0.05；与GANT61单独用药比较，cP<0.05

本研究单独应用姜黄素作用于HL-60细胞，显示其可抑制HL-60细胞增殖、促进凋亡，且这些作用受时间和剂量影响。培养至24 h时，5.0 μmol/L和20.0 μmol/L姜黄素对HL-60细胞增殖抑制率分别约为5%和40%，与吴裕丹等[18]和闵旻等[19]研究结果一致。Hh信号通路转录因子Gli1、Gli2至少有一个持续性活化，这对肿瘤的发展非常重要[20-23]。下游Gli转录因子是Hh通路转导终末阶段，不同的通路活化路径最终通过Gli发挥作用，因此，Gli特异性抑制剂比上游特异性抑制剂具有更大的适用性[9]。HL-60细胞中Hh信号通路活化不依赖转导因子SMO，rshh和特异性SMO抑制剂cyclopamine对HL-60细胞增殖、凋亡无作用，然而30 μmol/L GANT61可抑制其增殖，促进其凋亡[24]。因此选用30 μmol/L GANT61进行实验。窦志金等[7]研究表明，姜黄素通过抑制Hh信号通路，进而抑制胶质瘤细胞增殖及细胞集落形成，并显示出浓度和时间依赖性。因此本实验通过应用GANT61阻断HL-60细胞Hh信号通路，进而验证姜黄素是否通过Hh信号通路对HL-60细胞的增殖、凋亡起作用。本研究结果显示，姜黄素和GANT61联合用药后对HL-60细胞增殖抑制作用高于单独应用姜黄素，联合用药时姜黄素浓度越高，作用时间越长，增殖抑制作用越强。在姜黄素和GANT61联合用药对HL-60细胞凋亡影响研究发现，联合用药凋亡率高于单独用药。研究发现，姜黄素通过抑制Sonic Hh信号通路，进而抑制成神经管细胞瘤细胞增殖、促进凋亡[25]，因此，笔者推测姜黄素可能是通过Hh信号通路对HL-60细胞的增殖、凋亡发挥作用，但其具体作用机制仍有待进一步研究。

姜黄素抗癌机制复杂，至今未完全清楚，但其抗瘤的作用已得到大量研究证实。随着研究的不断深入，其可能在治疗白血病领域形成一个新热点。

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(本文编辑：贾萌萌)

Influence of Curcumin on the Proliferation and Apoptosis of HL-60 Cells and Its Mechanism

MENGTeng-teng，WEIHong，GUANDong-fang，etal.

DepartmentofHistologyandEmbryology，CollegeofMedicine，ShiheziUniversity，Shihezi832002，China

Objective To investigate the influence of curcumin on the proliferation and apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells and its possible mechanism.Methods We divided the included HL-60 cells into trial group，negative control group and blank control group.The trial group was further divided into single subgroups(0，2.5，5.0，10.0，20.0，40.0 μmol/L curcumin)and combined subgroups(5.0，10.0，20.0 μmol/L curcumin+30 μmol/L GANT61).Observations were conducted 24 hours and 48 hours after the trial began.CCK-8 method was used to detect the proliferation of HL-60 cells，and the proliferation inhibition rate was calculated.In vitro combined application of medicines was investigated to observe whether synergistic effect exists.AnnexinⅤ-FITC/PI double-stained method was employed to detect the apoptosis rate of cells.Results The single subgroup and combined subgroup were significantly different(P<0.05)in 24 h and 48 h inhibition rates；the 5.0，10.0 and 20.0 μmol/L combined subgroups were significantly different from 5.0，10.0 and 20.0 μmol/L single subgroups in 24 h and 48 h proliferation inhibition rates；10.0 and 20.0 μmol/L combined subgroups and 0 μmol/L combined subgroup were significantly different(P<0.05)in 24 h and 48 h inhibition rates.Antagonistic effect occurred in the combined subgroup with 5.0 μmol/L curcumin+30 μmol/L GANT61 on 24 h proliferation inhabitation rate，and pure additive effect occurred in this group on 48 h proliferation inhabitation rate；potentiation occurred in the combined subgroups with 10.0 or 20.0 μmol/L+30 μmol/L GANT61 on 24 h and 48 h proliferation inhabitation rates.Curcumin，GANT61 and curcumin+GANT61 were significantly different(P<0.05)in the effect on 24 h and 48 h apoptosis rates；the 10.0 and 20.0 μmol/L combined subgroups were significantly different(P<0.05)from 10.0 and 20.0 μmol/L single subgroups in 24 h apoptosis rate；the 5.0，10.0 and 20.0 μmol/L combined subgroups were significantly different(P<0.05)from 5.0，10.0 and 20.0 μmol/L single subgroups in 48 h apoptosis rate；the combined application of 5.0，10.0 or 20.0 μmol/L curcumin+GANT61 was significantly different(P<0.05)from the single use of GANT61 in apoptosis rate.Conclusion The combined application of curcumin and GANT61 has synergistic inhibition effect on the proliferation of HL-60 cells and obviously speeds up the apoptosis of HL-60 cells.Its efficacy has correlation with concentration and time.Curcumin may take effects by inhibiting Hedgehog signaling pathway.

Leukemia,myeloid,acute；Curcumin；GANT61；Hedgehog-Gli signaling pathway

国家自然科学基金资助项目(81460024)；石河子大学优秀青年项目(2013ZRKXYQ26)

832002新疆石河子市，石河子大学医学院组织胚胎学教研室(孟腾腾，魏虹，管东方，张志威)；石河子大学医学院第一附属医院血液风湿科(吴广胜)；石河子大学医学院(齐新宇)

魏虹，832002新疆石河子市，石河子大学医学院组织胚胎学教研室；E-mail：weihong-2@163.com

R 733.72

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.23.013

2015-04-28；

2015-06-06)

孟腾腾，魏虹，管东方，等.姜黄素对人早幼粒白血病细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究[J].中国全科医学，2015，18(23)：2800-2804.[www.chinagp.net]

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