早产儿不同浓度氧暴露后外周血单个核细胞内p47phox蛋白与活性氧产生的相关性研究*

张玲萍，董文斌

（四川医科大学附属第一医院新生儿科，四川 泸州 646000）

·论著·

早产儿不同浓度氧暴露后外周血单个核细胞内p47phox蛋白与活性氧产生的相关性研究*

张玲萍，董文斌

（四川医科大学附属第一医院新生儿科，四川 泸州 646000）

目的观察早产儿不同浓度氧暴露后，外周血单个核细胞（PBMCs）内p47phox蛋白变化与活性氧（ROS）产生的相关性。方法32周以下早产儿不同浓度氧疗48 h后，分离PBMCs，检测PBMCs内p47phox的定位情况、p47phox蛋白表达量及ROS的生成量。结果p47phox随着吸氧浓度升高向细胞膜移位增加；p47phox的蛋白表达量及ROS生成量也随着吸氧浓度的升高而增加。结论早产儿氧暴露后，p47phox可能通过更多的向胞膜移位，增加其表达量来引起ROS产生的增加。

早产儿；氧暴露；p47phox；活性氧

近年来，早产儿出生率显著提高，早产儿因为肺发育不成熟需要不同方式的氧疗支持。也正是因为这种通气策略的改变，早产儿存活率也得到显著的升高。可是，长期高浓度供氧引起早产儿急、慢性肺损伤却凸显出来。有研究显示，高氧诱导的氧化应激反应，产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）是其重要的发病机制[1-2]。机体产生活性氧有多种途径，其中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶是血管内生成活性氧的主要酶体[3]，同时也在肺血管内皮细胞内表达，这种表达有助于高氧诱导活性氧生成后，肺组织发生炎症反应和组织损伤[4]。NADPH氧化酶是由多亚基构成的酶复合体，其中p47phox是NADPH氧化酶活性有关的重要调节因子。当机体受到细胞因子、激素及炎症等因素的刺激，p47phox会发生一系列变化，最终携带胞质复合体定位在胞膜上，从而激活NADPH氧化酶，产生大量的活性氧[5-6]。本研究旨在观察早产儿不同浓度氧暴露后，外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）内p47phox蛋白定位及表达量的变化，与ROS的生成量的情况，来探讨p47phox蛋白变化与活性氧产生的关系。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

离心机（北京医用离心机厂），超净工作台（Thermo公司），倒置相差显微镜（Olympus公司），荧光显微镜（Olympus公司），激光共聚焦显微镜（Leica公司），全光谱分光光度仪（Eppendorf，德国），电泳仪（美国伯乐），GDS8000凝胶扫描系统（UVP，美国），超低温冰箱（Thermo公司）等。

1.2 主要试剂

人淋巴细胞分离液（灏洋生物制品科技有限责任公司），Mitosox Red（Invitrogen公司），DAPI（Sigma公司），抗荧光淬灭封片剂（碧云天公司），兔抗人p47phox抗体（Bioworld Technology），FITC山羊抗兔IgG（中杉金桥公司），5XSDS上样缓冲液（上海生工），蛋白裂解液（北京普利莱），10%分离胶（Amersham Pharmacia Biotech公司），4%浓缩胶（Amersham Pharmacia Biotech公司），X-光胶片（柯达公司），HRP二抗（GenScript公司），甘油醛-3-磷酸脱氢酶内参一抗（GenScript公司）等。

1.3 研究对象及分组

以2013年收治于我科的32周以下早产儿为对象。将其中入院时诊断为新生儿呼吸窘迫综合症[7]且需要吸氧的患儿作为氧暴露组，根据吸氧浓度不同分为3组：FiO2<30%为低浓度吸氧组、FiO2在30%～40%为中浓度吸氧组、FiO2>40%为高浓度吸氧组。同期选择10例32周以下无其他疾病且暂未吸氧的早产儿作为对照组。两组患儿胎龄、出生体重差异无统计学意义，具有可比性。该实验通过四川医科大学附属第一医院伦理委员会的批准，所有患儿进行实验前均征得家属同意并签署知情同意书。

1.4 实验方法

1.4.1 标本采集氧暴露组早产儿吸氧48 h后，对照组患儿出生48 h后，均经桡动脉采血2 ml，置于肝素抗凝管中，采用Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs。

1.4.2 荧光显微镜检测PBMCs内p47phox定位经Ficoll密度梯度离心法分离得到PBMCs后，用少量RPIM 1640培养液（含10%胎牛血清）重悬细胞，采用计数板调节细胞浓度为2×106个/ml；取100μl细胞悬液滴于防脱玻片上，观察细胞贴附于玻片时，滴加少量4%多聚甲醛覆盖住细胞层，固定20 min；洗涤细胞后，加入50μl封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育15min；洗涤细胞后，将磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）稀释的p47phox抗体（1∶50）滴加于载玻片上，覆盖住细胞层，4℃冰箱过夜；次日，将FITC标记的山羊抗兔抗体稀释后（1∶50）滴于载玻片上，37℃湿盒温育1 h；洗涤细胞后，滴入30μl抗荧光淬灭剂封片并采用荧光显微镜采集图像。Image Pro Plus软件中的Line Profile（光谱廓线）测定细胞内荧光强度分布[8]。

1.4.3 Western-blot检测PBMCs内p47phox蛋白表达量收集细胞，加入适量放射免疫沉淀分析裂解液。冰上操作后，高速离心，提取蛋白；紫外分光光度计，595 nm，1号管调零，制出标准曲线，标准方程及R值，测量待测蛋白OD值，算出蛋白浓度；制备分离胶、蛋白上样、电泳、转膜及封闭；取出聚偏二氟乙烯膜，缓冲液冲洗后，暗室内进行化学发光，胶片曝光显影后收集结果。然后用UVP凝胶图象处理系统Labworks 4.6软件分析目的条带的灰度值[9]。

1.4.4 荧光显微镜检测PBMCs内ROS水平首先将分离得到的PBMCs调整浓度为2×106个/ml。取100μl滴加于防脱玻片上，4%多聚甲醛固定20 min，洗涤细胞；按说明书配制Mito SOX探针，浓度为3.85μg/ml，滴加1 ml覆盖住细胞层，37℃孵育30 min，洗涤细胞；每张玻片加入100μl DAPI蓝色荧光染料染细胞核，3 min后，洗涤细胞；滴加30μl抗荧光淬灭剂于载玻片上进行封片，激光共聚焦显微镜采集图像；Image Pro Plus软件测定图像平均荧光强度，其荧光强度越强，ROS表达越多[10]。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计学处理。计数资料采用率表示，χ2检验进行统计分析；计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，方差分析进行统计，组间比较采用q检验；两变量间的关系采用直线相关进行分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫荧光检测PBMCs内p47phox定位

采用Image Pro Plus软件中的LineProfile测定细胞内荧光强度分布（图1）。对照组（见图A）中，细胞1和2由1条直线穿过，对直线经过区域的荧光强度分布进行测定，结果发现，荧光强度曲线呈平台状均匀分布（A1、A2所示），说明p47phox主要均匀分布于胞质中；低浓度吸氧组中，细胞荧光强度曲线也呈平台状，分布较均匀（B1、B2所示）；而中浓度吸氧组组中，部分细胞荧光强度曲线呈平台状（C1所示），p47phox在胞质分布均匀，部分细胞荧光强度曲线呈两侧高中间低的双峰状（C2所示），说明p47phox在胞膜附近先升高，胞质中降低，靠近胞膜处又升高，此时p47phox已主要聚集在胞膜附近，此为发生了p47phox移位的阳性细胞；而高浓度吸氧组中，细胞荧光强度分布呈明显的双峰状，（D1、D2所示），p47phox向胞膜移位的阳性细胞更加明显。

由于各组中p47phox移位的阳性细胞数不同，本实验前期结果已对其移位率进行了统计。对照组发生p47phox移位的细胞数仅为1.02%；低浓度吸氧组p47phox移位率为7.69%；中浓度吸氧组p47phox移位率为21.69%；而高浓度吸氧组中，p47phox移位率为53.07%，明显高于其他3组（P<0.05）[11]。

2.2 Western-blot检测PBMCs内p47phox表达量

Western blot结果显示，吸氧浓度的升高可诱导p47phox蛋白表达上调。对照组p47phox蛋白相对表达量为（0.26±0.024），低浓度吸氧组、中浓度吸氧组及高浓度吸氧组p47phox表达逐渐增加，分别为（0.70±0.028）、（0.81±0.013）及（0.84±0.023）。经统计，各组间p47phox蛋白表达差异具有统计学意义，F=144.49，P<0.01。与对照组相比，其余3组p47phox蛋白表达明显增加，P<0.05。且高浓度吸氧组中p47phox蛋白表达明显高于中浓度吸氧组和低浓度吸氧组，P<0.05。见图2。

2.3 荧光显微镜检测PBMCs内ROS水平

对照组患儿PBMCs内ROS平均荧光强度为（14.60±0.76）；低浓度吸氧组为（18.34±0.19）；中浓度吸氧组为（23.11±0.84）；高浓度吸氧组为(32.88± 1.32)（见图3）。随着吸氧浓度的升高，ROS的产生逐渐增加。与对照组相比，差异均具有统计学意义；且任何两组间平均荧光强度均有差别（均P<0.05）。

2.4 p47phox蛋白表达与ROS产生的相关性分析

临床中早产儿氧暴露48 h后，随着吸氧浓度的升高，PBMCs内ROS逐渐升高。同时氧浓度的升高还诱导p47phox蛋白表达上调，这与ROS升高的趋势是一致的。经直线相关进行分析后，得到相关系数r=0.78，P<0.05，p47phox蛋白表达与ROS的产生呈显著的正相关关系。

图1 免疫荧光检测p47phox在PBMCs内定位（×400）

图2 外周血单个核细胞内p47phox相对表达量

图3 外周血单个核细胞内活性氧水平（×200）

图4 p47phox蛋白表达与ROS含量的散点图

3 讨论

氧疗，是呼吸支持的重要方式。但长期高浓度用氧引起的急、慢性肺损伤是造成早产儿尤其是极低出生体重儿死亡或致残的重要原因。有研究显示，在高氧环境机体发生氧化应激反应，产生大量ROS是其发病的重要机制。NADPH氧化酶是一种过氧化物酶，广泛存在于吞噬细胞及非吞噬细胞，其催化产物ROS就是参与氧化应激损伤的重要因素。NADPH氧化酶主要由5个亚基组成，包括胞膜组分gp91phox、p22phox，胞质组分p40phox，p47phox，p67phox和小分子的GTP结合蛋白Rac-1或Rac-2[12]。当细胞受到相应刺激后，胞浆亚基p47phox发生磷酸化，构象发生改变与p67phox组装并向胞膜转位，与胞膜亚基p22phox结合，从而激活了NADPH氧化酶，将氧分子还原为单线态氧[13-14]，进而引起氧化应激，造成组织细胞损伤。在此ROS的产生过程中，胞浆亚基p47phox起着枢纽性的作用。因此，本实验通过早产儿氧暴露后，观察PBMCs内p47phox的变化与ROS的产生，来探讨p47phox与ROS产生的关系。

前期研究发现，早产儿氧暴露后，随着吸氧浓度的升高，p47phox向胞膜移位的细胞数增多。在机体受到刺激的情况下，p47phox向胞膜的移位率增加，这与国内外众多研究是相一致的。随着研究不断地深入，笔者进一步在实验中发现，随着患儿用氧浓度升高，该组患儿PBMCs内p47phox表达在逐渐增加。同时，ROS也在逐渐增多。这与p47phox的表达量是呈正相关的。这提示，用氧浓度的升高不仅可能增加p47phox向胞膜移位，还可能诱导p47phox蛋白表达上调。而p47phox可能通过增加向胞膜移位，上调其表达量，激活更多的NADPH氧化酶，产生更多的活性氧，加重早产儿机体组织的损伤。通过对这种机制的进一步探索，有助于从源头上控制过多活性氧的产生，以期为预防早产儿肺组织发生炎症反应或其他多种氧化应激损伤性疾病提供新的治疗靶点和临床思路。

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Study on the relationship between p47phox and ros within pbmcs in premature infants after oxygen therapy*

Ling-ping ZHANG,Wen-bin DONG
(Department of Geriatrics,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou,Sichuan 646000,P.R.China)

【Objective】To observe the correlation of p7phox and ROS in PBMCs after different concentration oxygen exposure in preterm infants.【Methods】After oxygen therapy for 48 h in extremely premature infants.We isolated PBMCs from peripheral blood.Then detected the location and expression of p47phox and ROS within PBMCs.【Results】The higher oxygen concentrated,the more PBMCs have p47phox translocate to membrane,the expression of p7phox and ROS production raised as well.【Conclusion】After oxygen therapy,p47phox may increase the translocation,up-regulate expression to cause reactive oxygen species increasing.

premature infants;oxygen expose;p47phox;ROS

1005-8982（2015）34-0001-05

R72；R392

A

2015-05-25

国家自然科学基金（No：81571480）；中华儿科杂志第二届双鹤珂立苏科研基金（No：cjp2011-009）；四川省卫生厅科研基金（No：110340）

董文斌，E-mail：DongWenbin2000@163.com