α-硫辛酸对脑缺血再灌注大鼠的保护作用及可能机制研究

王梦旻，陶智，杨志红，吕卉芳

（湖北省武汉市黄陂区人民医院药剂科，湖北 武汉 430300）

·论著·

α-硫辛酸对脑缺血再灌注大鼠的保护作用及可能机制研究

王梦旻，陶智，杨志红，吕卉芳

（湖北省武汉市黄陂区人民医院药剂科，湖北 武汉 430300）

目的观察α-硫辛酸对大鼠脑缺血再灌注的保护作用，对其作用机制进行初步探索。方法将SD大鼠随机分为假手术组、模型组和实验组，每组20只，采用线栓法制备缺血再灌注模型，实验组于灌注前30 min腹腔注射α-硫辛酸20 mg/kg，假手术组和模型组腹腔注射等量生理盐水。观察并比较两组大鼠神经功能评分、心肌损伤标志物和氧化应激相关指标、NF-κB、TNF-α及Caspase-3表达水平。结果实验组大鼠神经功能评分显著低于模型组（P<0.05），差异具有统计学意义。实验组大鼠cTnⅠ、MDA及GSH-Px含量显著低于模型组，SOD含量显著高于模型组（P<0.05），差异具有统计学意义。实验组大鼠NF-κB、TNF-α和Caspase-3蛋白表达量显著低于模型组（P<0.05），差异具有统计学意义。结论α-硫辛酸可改善脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损，降低脑缺血再灌注诱导的氧化应激水平，提高脑细胞抗氧化能力，同时抑制Caspase-3介导的细胞调亡，从多途径发挥脑缺血再灌注保护作用。

缺血再灌注；α-硫辛酸；cTnⅠ；MDA；GSH-Px；SOD；NF-κB；TNF-α；Caspase-3

缺血再灌注损伤是指在缺血基础上恢复血流供应后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象[1]。氧化应激和炎性反应是造成神经功能缺损的重要原因，NF-κB是核心环节[2]。此外，Caspase-3作为细胞凋亡级联反应的关键因子，在缺血再灌注损伤中起着重要作用[3]。本文通过线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型，旨在研究α-硫辛酸对大鼠脑缺血再灌注的保护作用，初步探讨其作用机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年SD大鼠60只。雌雄各半；体重220～250 g；购自北京维通利华实验动物技术有限公司，适应性饲养7 d后开始实验。

1.2 实验药品

α-硫辛酸购自上海现代制药股份有限公司，国药准字H20045444。

1.3 实验试剂和仪器

1.3.1 实验试剂心肌肌钙蛋白I（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）检测试剂盒购自南京基蛋生物科技有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测试盒及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）测试盒购自南京建成生物工程研究所，Caspase-3一抗（Santa cruz公司，美国），山羊抗小鼠IgG（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3.2 实验仪器酶标仪（Bio-RAD公司），电热恒温水浴箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），漩涡混匀器（苏州珀西瓦尔实验设备有限公司），电泳仪（Life Technologies公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物分组及给药60只大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组和实验组，每组各20只。实验组于灌注前30 min腹腔注射α-硫辛酸20 mg/kg，假手术组和模型组腹腔注射等量生理盐水。

1.4.2 大鼠缺血再灌注模型建立[4]大鼠术前12 h禁食不禁水。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后仰卧固定于手术台，75%乙醇消毒颈部皮肤，沿颈部正中切开，暴露右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，在颈内和颈外动脉分叉处结扎颈外动脉分支。采用手术线结扎颈总动脉近心端，动脉夹夹闭左侧颈内动脉，结扎并切断左侧颈外动脉，下拉近心端，与左侧颈内动脉呈直线。将尼龙线插入颈内动脉达大脑中动脉，栓线的血管外部分结扎固定。阻断血流90 min后拔除栓线，实现再灌注。假手术组结扎动脉但不插入栓线，其余操作同模型组。再灌后16 h处死大鼠检测相关生化指标。

1.5 检测指标

1.5.1 大鼠神经功能评分参照Longa 5分制评分标准评定神经功能。0分：无神经损伤；1分：左前肢伸展障碍；2分：向左打圈；3分：行走时向左侧倾倒；4分：意识昏迷；5分：死亡。

1.5.2 心肌损伤标志物和氧化应激相关指标检测取心脏组织进行如下检测免疫荧光定量法检测cTnⅠ含量，硫代巴比妥酸法检测MDA含量，黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性，比色法检测GSH-Px活性。

1.5.3 TNF-α检测取大鼠缺血脑组织采用免疫组化法检测TNF-α含量。断头法处死大鼠，4%多聚甲醛固定后以视交叉前缘作2 mm厚冠状位切片，脱水、透明、石蜡包埋，作4μm厚脑组织冠状切片。石蜡切片脱蜡水化后滴加TNF-α一抗4℃过夜孵育，PBS冲洗3次，5 min/次。滴加生物素标记的二抗工作液，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，5 min/次。滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，5 min/次。DAB显色剂显色15 min，苏木素复染，免疫组化的定量分析采用灰度值分析。

1.5.4 NF-κB和Caspase-3检测取大鼠缺血脑组织采用Western blot法检测NF-κB和Caspase-3蛋白表达。断头法处死大鼠取脑组织，迅速置于预冷的生理盐水中，洗去表面血迹。取缺血侧大鼠脑组织，剪碎成2 mm×2 mm的小块，置入匀浆器中匀碎。将匀浆液移至离心管中加入裂解液裂解10 min，4℃下13 000 r/min离心10 min，取上清液用于检测。按照Bradford法检测细胞总蛋白含量，分离胶浓度10%，浓缩胶浓度5%，分离胶电泳电压80 V，浓缩胶电泳电压100 V；转膜电压设置为90 V，120 min。5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，—抗按照1∶500稀释后与膜4℃杂交过夜，二抗按照1∶2 000稀释后与膜杂交90 min。孵育结束，TBST洗3次，每次15 min，加入显影液暗室压片后曝光。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，采用t检验或F检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较

随着再灌注时间的延长，两组大鼠神经功能评分不断增高，表明再灌注加剧神经功能损伤。各时间点比较，实验组大鼠神经功能评分显著低于模型组（P<0.05），差异具有统计学意义，表明α-硫辛酸对再灌注后的神经损伤具有一定的保护作用。见表1。

表1 各组大鼠缺血再灌注后不同时间点神经功能评分比较（n=20，分±s）

表1 各组大鼠缺血再灌注后不同时间点神经功能评分比较（n=20，分±s）

注：覮与模型组比较，P<0.05

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2.2 各组大鼠血浆指标检测结果比较

模型组大鼠心肌梗死标志物cTnⅠ和氧化应激指标MDA、GSH-Px含量显著升高，SOD活性显著降低，与假手术组比较差异具有统计学意义（P<0.05），表明心肌损伤和梗死同时存在，自由基损伤作用和抗氧化机制启动。与模型组比较，实验组大鼠cTnⅠ、MDA及GSH-Px明显降低，SOD明显增高（P< 0.05），表明α-硫辛酸对缺血再灌注诱发的氧化应激有明显的抑制作用。见表2。

表2 各组大鼠血浆指标检测结果比较（±s）

表2 各组大鼠血浆指标检测结果比较（±s）

注：1）与假手术组比较，P<0.05；2）与模型组比较，P<0.05

组别cTnⅠ/（μg/L）GSH-Px/（u/L）假手术组2.55±0.453.15±0.26227.43±16.72679.82±36.70模型组8.37±2.361）8.38±2.381）148.33±12.941）887.35±48.971）实验组5.47±10.371）2）5.32±1.411）2）183.83±9.731）2）739.33±315.091）2）F值66.42553.659173.868137.694 P值0.000.000.000.00 MAD/（nmol/L）SOD/（u/L）

2.3 各组大鼠TNF-α检测结果比较

与假手术组比较，模型组大鼠TNF-α蛋白表达量显著升高（P<0.05），差异具有统计学意义。与模型组比较，实验组大鼠TNF-α蛋白表达量显著降低（P<0.05），差异具有统计学意义，表明α-硫辛酸可能通过抑制TNF-α表达从而抑制大鼠脑缺血再灌注损伤后的炎症反应。见附图及表3。

附图 各组大鼠TNF-α检测结果比较

表3 各组大鼠TNF-α检测结果（±s）

表3 各组大鼠TNF-α检测结果（±s）

注：1）与假手术组比较，P<0.05；2）与模型组比较，P<0.05

组别TNF-α假手术组32.91±6.31模型组46.89±7.041）实验组40.87±7.361）2）F值20.554 P值0.00

2.4 各组大鼠NF-κB和Caspase-3检测结果比较

与假手术组比较，模型组大鼠NF-κB和Caspase-3蛋白表达量显著升高（P<0.05），差异具有统计学意义。与模型组比较，实验组大鼠NF-κB和Caspase-3蛋白表达量显著降低（P<0.05），差异具有统计学意义，表明NF-κB和Caspase-3在缺血后迟发性神经元死亡中具有重要作用。见表4。

表4 各组大鼠NF-κB和Caspase-3蛋白表达量比较（±s）

表4 各组大鼠NF-κB和Caspase-3蛋白表达量比较（±s）

注：1）与假手术组比较，P<0.05；2）与模型组比较，P<0.05

组别Caspase-3NF-κB假手术组1.20±0.141.29±0.33模型组3.74±0.891）3.26±0.911）实验组2.68±0.641）2）2.29±0.711）2）F值79.96140.398 P值0.000.00

3 讨论

随着社会的不断进步和生活方式的逐步改变，脑中风发病率在全球范围内呈日益增长的趋势，严重威胁人类健康。其中，缺血性脑中风是血栓形成或动脉栓子造成脑动脉的阻塞，进而造成局灶性脑缺血[4]。临床治疗缺血性脑中风以尽早恢复血流灌注为原则，但是，近年来研究发现，缺血后血流恢复会进一步加剧组织损伤和功能障碍，造成缺血再灌注损伤[5]。

α-硫辛酸是硫醇类化合物，兼具脂溶性和水溶性，口服和静脉给药均能良好吸收，可透过血脑屏障[6]。α-硫辛酸具有很强的抗氧化能力，是人体必不可少的抗氧化剂。研究显示α-硫辛酸作用广泛，可清除多种活性氧、螯合金属离子、抗细胞凋亡及抗炎症反应等，临床主要用于治疗糖尿病周围神经病变[7]。近年来，多项研究表明α-硫辛酸预处理对多种组织器官缺血再灌注具有保护作用，如肾脏、心肌、肝脏和睾丸[8]。

氧化应激和炎性反应是缺血再灌注的重要机制。再灌注可导致自由基过度生成，细胞处于氧化应激状态，引起蛋白质和核酸过氧化，最终导致细胞死亡[9]。此外，炎性细胞和炎性介质参与缺血再灌注损伤的全过程，加重脑组织损伤，炎性细胞包括中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞等，炎性因子包括IL-1、IL-8和TNF-α等。NF-κB几乎存在于所有细胞内，是重要的核转录因子，参与免疫反应等过程。缺血再灌注损伤后释放的上游炎症因子，在IkBs激酶催化作用下IKB发生磷酸化，促使NF-κB激活进入细胞核与靶基因结合，从而释放下游相关因子（如IL-1β和TNF-α），诱发炎症反应，造成恶性循环[10]。细胞凋亡级联反应受基因调控，其中Caspase-3是下游关键因子，被称为“杀手蛋白”，在缺血再灌注损伤中发挥重要作用[11-12]。研究证实，鼠脑缺血后继发有心肌损伤。国内外研究显示病人脑出血后心肌酶谱改变于病后72 h之内变化最为明显，1周后恢复正常。脑组织缺血可以直接累及丘脑及丘脑下部植物神经功能紊乱，儿茶酚胺分泌增加等引起内脏器官功能改变，影响心脏传导系统和心肌复极化，引起冠脉痉挛与收缩等而造成心脏缺血、心肌营养不良坏死，导致心肌损伤。因此，本研究以心肌损伤标志物cTnⅠ，氧化应激指标MDA、GSH-Px、SOD，炎性因子TNF-α、NF-κB以及Caspase-3为检测指标，旨在探讨α-硫辛酸发挥缺血再灌注保护效应的作用机制。

本研究结果显示，实验组大鼠神经功能评分显著低于模型组（P<0.05），表明α-硫辛酸对缺血再灌注后的神经具有一定的保护作用。与模型组比较，实验组大鼠cTnⅠ、MDA及GSH-Px明显降低，SOD明显增高（P<0.05），表明α-硫辛酸对缺血再灌注诱发的氧化应激有明显的抑制作用。实验组大鼠TNF-α蛋白表达显著低于模型组（P<0.05），表明α-硫辛酸可能通过抑制TNF-α表达从而抑制大鼠脑缺血再灌注损伤后的炎症反应。实验组大鼠Caspase-3和NF-κB蛋白表达量显著低于模型组（P<0.05），表明α-硫辛酸可通过抑制Caspase-3和NF-κB蛋白表达抑制迟发性神经元死亡。

综上所述，α-硫辛酸可改善脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损，降低脑缺血再灌注诱导的氧化应激水平，提高脑细胞抗氧化能力，同时抑制Caspase-3介导的细胞调亡，从多途径发挥脑缺血再灌注保护作用。

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Protective effect of α-lipoic Acid on cerebral ischemia reperfusion injury in rats and its possible mechanism

Meng-min WANG,Zhi TAO,Zhi-hong YANG,Hui-fang LYU
(Department of Pharmacy,Huangpi People's Hospital,Wuhan,Hubei 430300,P.R.China)

【Objective】To observe the protective effect of α-lipoic acid in rat cerebral ischemia and reperfusion on its mechanism of preliminary exploration.【Methods】SD rats were randomly divided into sham operation group, model group and experimental groups of 20,prepared by suture ischemia-reperfusion model,the experimental group was injected intraperitoneally 30min before perfusion α-lipoic acid 20 mg/kg sham group and model group were injected with saline.Observe and compare the two groups of rats neurological function,cardiac injury markers and oxidative stress-related indicators,NF-κB,TNF-α and Caspase-3 expression levels.【Results】The experimental group of neurological scores were significantly lower than the model group(P<0.05),with a statistically significant difference.CTnⅠrats in the experimental group,MDA,GSH-Px were significantly lower than the model group, SOD were significantly higher than the model group(P<0.05),with a statistically significant difference.Experimental group NF-κB,TNF-α and Caspase-3 protein expression was significantly lower than the model group(P<0.05), with a statistically significant difference.【Conclusion】α-lipoic acid may improve cerebral ischemia and reperfusion in rats neurological deficits,reduce cerebral ischemia-reperfusion-induced oxidative stress,and improve the antioxidant capacity of brain cells,while inhibiting Caspase-3-mediated apoptosis from multi-channel play cerebral ischemia and reperfusion.

ischemia-reperfusion;α-lipoic acid;cTnⅠ;MDA;GSH-Px;SOD;NF-κB;TNF-α;Caspase-3

1005-8982（2015）34-0019-04

R743.31

A

2015-06-17

陶智，Tel：18040592217，E-mail：437025192@qq.com