TNF-α-308位点基因多态性与阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的相关性分析

朱琳琳，麦静愔(上海中医药大学附属曙光医院，上海200021)

TNF-α-308位点基因多态性与阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的相关性分析

朱琳琳，麦静愔
(上海中医药大学附属曙光医院，上海200021)

摘要:目的探讨TNF-α-308位点基因多态性与阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)的相关性。方法采用PCR产物直接测序法，对上海地区200例OSAHA患者(OSAHA组)和200例健康体检者(对照组)进行TNF-α-308位点基因多态性检测。结果TNF-α-308位点存在GG、GA和AA三种基因型。OSAHA组与对照组GA基因型频率分别为23.0%和15.5%，AA基因型频率分别为15.0%和1.5%，A等位基因频率分别为25.6%和9.6%，OSAHA组均明显高于对照组(P＜0.05或＜0.01)。多因素Logistic回归分析显示，GA基因型(OR =1.13，95%CI: 1.11～1.16)、AA基因型(OR =1.23，95%CI: 1.17～1.29)、A等位基因(OR =1.06，95%CI: 1.05～1.07)为OSAHS的易感因素，P均＜0.01。结论OSAHA的发病与TNF-α-308位点基因多态性存在相关性，携带AA基因型者发病风险较高。

关键词:阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征;多态性; TNF-α基因

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)是一种常见的睡眠障碍性疾病，具有家族聚集性和遗传性［1］;近年来遗传因素在OSAHS中的重要性日益受到重视，但结论不一［2，3］。关于OSAHS与易感因素相关性的研究逐渐成为研究的热点。本研究选取上海地区200例OSAHS患者为研究对象，对TNF-α-308位点进行基因多态性检测，探讨其与OSAHS的相关性。

1　资料与方法

1.1临床资料选择2012～2014年在上海中医药大学附属曙光医院呼吸科及睡眠呼吸监测中心就诊的OSAHS患者200例(OSAHS组)，其中男162例、女38例，年龄(49.2±8.7)岁。OSAHS患者均接受多导睡眠呼吸检测，均符合《阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征诊治指南》的诊断标准［1］。排除慢性呼吸系统疾病、自身免疫性疾病及其他感染性疾病。选择同期健康体检者200例作为对照组，其中男154例、女46例，年龄(47.7±6.8)岁。两组性别、年龄具有可比性。所有入选者均系近三代为上海地区、彼此间无血缘关系的原住居民，且签署书面的志愿书。本研究由上海中医药大学附属曙光医院的伦理委员会批准。

1.2多导睡眠呼吸监测所有受试者在上海中医药大学附属曙光医院睡眠监测中心接受多导睡眠呼吸监测(晚20: 00至次日晨8: 00)，采用澳大利亚生产的E型多导睡眠呼吸监测系统进行监测。

1.3 TNF-α-308位点基因多态性检测采用PCR产物直接测序法。采集两组清晨空腹静脉血5mL，注入含有EDTA的抗凝管中，摇匀，对样本编号并登记，留取全血置于－80℃冷冻保存。标本按照试剂盒说明，使用离心柱型柱式血液基因组DNA抽提试剂盒进行DNA提取，－20℃保存备用。参照Sakao等［4］设计的引物，正向引物为5'-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3'，反向引物为5'-GAGCGTCTGCTGGCTGGGTG-3'。引物由北京鼎国生物工程公司合成。PCR反应体系为35 μL: 10mmol/LdNTP混合物2 μL，10×Taq Buffer 3.5 μL，2U TaqdNA聚合酶，10 μmol/L上下游引物各1 μL，超纯水补足至35 μL。所用试剂均购置于北京鼎国生物工程公司。PCR扩增条件: 95℃预变性5min; 95℃变性30 s，63℃退火40 s以及72℃延伸60 s共35个循环;然后72℃延伸10min，最后4℃保存。将PCR扩增产物5mL加入预先加有溴化乙锭核酸染料的1.0%琼脂糖凝胶中电泳(电压120 V，20min)，在自动成像分析仪上成像。PCR产物由北京鼎国公司进行纯化测序。

1.4统计学方法采用SPSS17.0统计软件。直接计数法计算等位基因及基因型频率，各组间基因型

和等位基因频率的比较及Hardy-Weinberg遗传平衡定律的吻合度检验［5］采用χ2检验;计量资料以珋x±s表示，多因素调整采用Logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 TNF-α-308位点基因多态性测序结果TNF-α-308位点存在GG、GA和AA三种基因型，见插页Ⅱ图6。统计实验个体中三种基因型的数目，经χ2检验后基因型符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)，说明本研究采用的研究对象具有群体代表性。

2.2 TNF-α-308位点基因型及等位基因频率两组TNF-α-308位点基因型及等位基因频率比较差异均具有统计学意义(P＜0.05或＜0.01)。见表1。

表1　两组TNF-α-308位点基因型和等位基因频率比较［例(%)］

2.3TNF-α基因-308位点基因型及等位基因与OSAHS易感性的关系经多因素Logistic回归分析，GA基因型(OR = 1.13，95% CI: 1.11～1.16)、AA基因型(OR = 1.23，95% CI: 1.17～1.29)、A等位基因(OR =1.06，95% CI: 1.05～1.07)为OSAHS的易感因素(P均＜0.01)。

3　讨论

人类TNF-α基因位于染色体6p21.1-p21.3区域。研究表明，TNF-α基因多态性主要存在其启动子上游，包括－1196C/T、－1031T/C、－863C/A、－857C/T、－572A/C、－376G/A、－316G/A、－308G/A、－238G/A、－204T/C和+ 489G/A［6］。Louis等［7］发现，TNF-α-308 G/A突变杂合子的TNF-α产量显著性高于GG野生型，说明在机体发生相同的病理刺激后，TNF-α-308突变影响TNF-α基因的表达量，进而影响OSAHS的发生、发展。

本研究对TNF-α-308位点基因测序发现，OSAHS组GA和AA基因型频率及A等位基因频率均明显高于对照组。经多因素Logistic回归分析，GA基因型、AA基因型、A等位基因为患OSAHS的易感因素，且携带GA基因型和携带AA基因型者患OSAHS的风险增加(1.13倍和1.23倍)，明显大于携带GG基因型者。本研究结果与刘辉国等［8］、Wilson等［9］、关键等［10］、Riha等［11］的研究结果一致: A等位基因与OSASH的发病有相关性。

总之，TNF-α基因可能是OSAHS的一个遗传候选基因，启动子上游第308位点基因多态性增加了对OSAHS的易感性。OSAHS是复杂的多基因遗传病，不同种族人群之间的易感性可能存在一定的差异，在今后的研究中应继续扩大样本量，研究不同人群中TNF-α基因与OSAHS组易感性的相关性，同时对与OSAHS易感性相关的其他基因进行研究为最终揭示OSAHS发生、发展的分子机制提供更多的科学依据。

参考文献:

［1］中华医学会呼吸病学会睡眠呼吸疾病学组.阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征诊治指南［J］.中华结核和呼吸杂志，2012，35(1): 9-12.

［2］Bhushan B，Guleria R，Misra A，et al.TNF-alpha gene polymorphism and TNF-alpha levels in obese Asian indians with obstructive sleep apnea［J］.Respirmed，2009，103(3): 386-392.

［3］Riha RL，Brander P，Venellem，et al.Tumor necrosis factor-alpha(-308)gene polymorphism in obstructive sleep apnoea-hypopnoea syndrome［J］.Eur Respir J，2005，26(4): 673-678.

［4］Sakao S，Tatusumi K，Igari H et al.Association of tumor necrosis factor-alpha gene promoter poIymorphism with the presence of chronic obstructive pulmonarydisease［J］.Am J Respir Crit Caremed，2001，163(2): 420-422.

［5］Wu L，Chau J，Young RP，et al.Transforming growth factor-beta l genotype and susceptibility to chronic obstructivepulmonarydisease ［J］.Thorax，2004，59(2): 126-129

［6］GingomR，Silveira LJ，Miller YE，et al.Tumor necrosis factor gene polymorphisms are associated with COPD［J］.Eur Respir J，2008，31(5): 1005-1012.

［7］Louis E，Franchimontd，Piron A，et al.Tumor necrosis factor(TNF)gene polymorphism influences TNF-alpha production in lipoplysaccharide(LPS)-stimulated whole blood cell culture in healthy humans［J］.Clin Exp Immunol，1988，113(3): 401-406.

［8］刘辉国，管频，林枚，等.肿瘤坏死因子基因多态性呼吸暂停低通气综合征［J］.中华结核与呼吸杂志，2006，29(9): 596-599.

［9］Wilson AG，Symons JA，McDowell TL，et al.Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on transcript activation［J］.Proc Ned Acad Sci U S A，1997，94(7): 3195-3199.

［10］关建，易红良，孟丽丽，等.肿瘤坏死因子-a基因多态性与阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征及代谢综合征共病性研究［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科，2013，20(1): 1-11.

［11］Riha RL，Brander P，vennellem，et al.Tumour necrosis factor-alpha(-308)gene polymorphism in obstructive sleep apnoea-hypopnoea syndrome［J］.Eur Respir J，2005，26(4): 673-678.

收稿日期:( 2014-08-08)

通信作者:麦静愔，E-mail:maijingyin@126.com

文章编号:1002-266X(2015)36-0053-02

文献标志码:B

中图分类号:R767.13

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.020