结直肠癌组织中K-ras基因突变情况及其临床意义

刘珊，王丹，卢福昱，程波，石建玲，段恋，孙锁柱(第二炮兵总医院，北京00088;解放军第30医院)

结直肠癌组织中K-ras基因突变情况及其临床意义

刘珊1，王丹1，卢福昱2，程波1，石建玲1，段恋1，孙锁柱1(1第二炮兵总医院，北京100088;2解放军第302医院)

摘要:目的观察K-ras基因在结直肠癌组织中的突变情况，为临床开展结直肠癌个体化治疗提供依据。方法收集156份结直肠癌组织手术标本作为观察组，20份正常肠黏膜标本作为对照组。提取组织DNA，采用实时荧光定量PCR法检测K-ras基因突变情况。分析K-ras基因突变率及第12、13位密码子突变与结直肠癌患者临床病理特征的关系。结果对照组未检测出K-ras基因突变，观察组K-ras基因突变率为40.4%(63/156)，两组基因突变率比较，P＜0.05。K-ras基因突变率与结直肠癌患者性别、肿瘤部位、分化程度、病理分期、淋巴结转移及远处转移无关(P均＞0.05)，与年龄有关(P＜0.05)。观察组K-ras基因第12、13位密码子突变率分别为76.2%(48/ 63)和27.0%(17/63)，二者比较P＜0.05。观察组K-ras基因第12、13位密码子突变与结直肠癌患者肿瘤分化程度相关(P＜0.05)，与性别、年龄、肿瘤部位、病理分期、淋巴结转移及远处转移无关(P均＞0.05)。结论结直肠癌组织中K-ras基因突变率为40.4%，第12位密码子(GGT～GAT)突变是最常见类型。检测K-ras基因突变情况有助于指导临床开展结直肠癌个体化治疗。

关键词:肠肿瘤;结直肠癌; K-ras基因;基因突变

K-ras genemutations in colorectal carcinoma and its clinical significance

LIU Shan1，WANGdan，LU Fu-yu，CHENG Bo，SHI Jian-ling，DUAN Lian，SUN Suo-zhu(1 General Hospital of the Second Artillery，Beijing 100088，China)

Abstract:Objective To observe the K-ras genemutations in the colorectal carcinoma tissues and to provide basis for the individualized treatment of colorectal cancer in clinical.Methods A total of 156 cases of colorectal carcinoma samples(observation group)and 20 cases of normal tissue samples(the control group)were collected.GenomicdNA was extracted and K-ras genemutations were analyzed by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction.Then，we analyzed the K-ras genemutation rate.Meanwhile，the 12th and 13th codonmutations in colorectal cancer and the relationships with clinicopathologic features were analyzed.ResultsThe K-ras genemutations were not found in the control group，and K-ras genemutation rate in the observation group was 40.4%(63/156).Significantdifference was found in themutation rate between these two groups(P＜0.05).The K-ras genemutation rate was not related with sex，tumor location，tumor grade，pathological stage，lymph node and lymph nodemetastasis(all P＞0.05)，but was related with age(P ＜0.05).Themutation rate at codon 12 and codon 13 of K-ras gene was 76.2%(48/63)and 27.0%(17/63)，respectively in the observation group，and significantdifference was found(P＜0.05).Themutation at codon 12 and codon 13 of K-ras gene was related with tumordifferentiateddegree(P＜0.05)，but not related with sex，age，tumor location，pathological stage，lymph node and lymph nodemetastasis(all P＞0.05).Conclusions K-ras genemutation rate in the colorectal carcinoma tissues is 40.4%，and themost common type is the codon 12(GGT-GAT)mutation.Thedetection of K-ras genemutation helps to provide basis for the individualized treatment of colorectal cancer in clinical.

Key words:intestinal neoplasms; colorectal carcinoma; K-ras gene; genemutation

在散发性结直肠癌的研究中，K-ras基因突变被认为是肿瘤发生的早期事件，并在肿瘤发展、转移、复发等阶段起重要作用［1～3］。本研究观察了结直肠癌根治术癌组织中K-ras基因突变状况，并探讨其与结直肠癌患者临床病理特征的关系，旨在为结直肠癌的个体化治疗提供依据。

1　资料与方法

1.1临床资料收集2010年1月～2012年11月第二炮兵总医院手术切除所得的结直肠癌根治病理标本156份作为观察组，患者男88例、女68例，年龄20～89岁、中位年龄68岁;肿瘤位于结肠76例，直肠80例;均经手术、病理检查证实诊断。按2008 年IARC出版的WHO消化系统肿瘤分类标准及病理分期标准，高度化14例、中度分化121例、低度分化20例;病理分期(pTNM分期)Ⅰ期29例，Ⅱ期47例，Ⅲ期69例，Ⅳ期11例;有淋巴结转移72例、无淋巴结转移84例。选择同期20份正常人肠黏膜组织作为对照组。两组性别、年龄具有可比性。

1.2 K-ras基因突变检测采用实时荧光定量PCR法。两组标本经10%中性甲醛固定及石蜡包埋，10 μm厚切片，取10张，确保观察组切片含有70%以上的肿瘤组织。DNA提取:使用德国Qiagen公司的DNA提取试剂盒提取石蜡标本基因组DNA。实时荧光定量PCR:采用的PCR仪为Applied Biosystems公司的7500型实时荧光定量PCR仪。参照武汉友芝友医疗科技有限公司的人类K-ras基因7种突变检测试剂盒进行。主要步骤:于0.2mL的离心管中依次加入PCR buffer 22.3 μL、酶混合物0.2 μL、参比染料0.4 μL、内标模板0.1 μL、待测肿瘤组织DNA 2 μL，总反应体积为25 μL。反应条件:预变性95℃、5min，然后95℃、15 s，60℃、60 s，共40个循环。阴性质控标准品采用灭菌双蒸水。

1.3统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计数资料以率表示，组间比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 K-ras基因突变情况对照组未检测出K-ras基因突变，均为野生型;观察组K-ras基因突变率为40.4%(63/156);两组基因突变率比较，P＜0.05。观察组共检测出突变型K-ras的5种类型，依次为第12位密码子GGT→GAT，为39.7%(25/63)，第13位密码子GGC→GAC，为27.0%(17/63)，第12位密码子GGT→GTT，为22.2%(14/63)，第12位密码子GGT→AGT，为7.9%(5/63)，第12位密码子GGT→TGT，为6.3%(4/63)。观察组K-ras基因第12、13位密码子突变率分别为76.2%(48/63)和27.0%(17/63)，两者比较P＜0.05。突变均为杂合性体细胞错义突变，未发现胚系(纯合)基因突变。有2例出现第12、13位密码子同时突变的复合突变，且均为GGT→GAT、GGC→GAC。

2.2 K-ras基因突变与结直肠癌患者临床病理特征的关系K-ras基因突变与结直肠癌患者年龄有关(P＜0.05)，而与性别、肿瘤部位、分化程度、病理分期、淋巴结转移及远处转移无关(P均＞0.05)。详见表1。

表1　K-ras基因突变与结直肠癌患者临床病理特征的关系

2.3观察组K-ras基因突变位点与患者临床病理特征的关系观察组K-ras基因第12位与第13位密码子突变在肿瘤分化程度上比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而在性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤分期、淋巴结转移及远处转移等因素上比较差异无统计学意义(P均＞0.05)。详见表2。

3　讨论

国外研究报道，结直肠癌K-ras基因突变率为30%～60%，东方人种略低于西方国家(25%～43%)，但无明显统计学差异［4，5］。结直肠癌中K-ras基因突变主要集中在1号外显子的12、13密码子上，少数存在2号外显子61、63密码子的突变［6］。数据显示12密码子发生突变频率最高，达70%以上，西方国家以GGT→GTT最常见，而亚洲以GTT→GAT最常见。本研究对照组未检测出K-ras基因突变，观察组K-ras基因突变率为40.4%，以第12位密码子GTT→GAT突变比例最高，均与以往研究报道一致。提示K-ras基因突变可作为诊断结直肠癌的分子指标。本研究2例同时存在第12、13位密码子复合突变，经过重复试验结果相同，表明K-ras基因突变在结直肠癌发生、发展的整个过程中可能存在多个阶段，发生多次不同突变的动态现象。

表2　观察组K-ras基因突变位点与患者临床病理特征的关系

以往研究对K-ras基因突变与患者临床病理特征间的相关性研究结果不尽相同［7～10］。本研究结果显示，K-ras基因突变与患者性别、肿瘤部位、分化程度、病理分期及有无淋巴结及远处转移无明显相关性，尤其是在肿瘤转移趋势上没有明显相关性，与国内外的相关报道存在一定差异，我们认为可能与样本量、检测方法、人种差异性等原因有关。本研究结果显示，K-ras基因突变与患者年龄相关，存在K-ras基因突变发生率随患者年龄增加而逐步升高的趋势(＜40岁年龄段突变率18.2%，＞60岁年龄段突变率48.4%)。多数学者认为，K-ras基因突变与结直肠癌预后不良密切相关，患者无法从靶向药物中获益，我国人口老龄化趋势的逐年显著使得结直肠癌的预后不良性更加明显。

有研究认为，K-ras基因的第12、13位点突变提示预后不良，存在13位点突变的患者更容易复发［11～13］。本研究中，K-ras基因的第12与13位密码子突变在肿瘤分化程度上比较差异有统计学意义，肿瘤在高分化状态下几乎全部出现第12位密码子突变，而第13位密码子突变在低分化时发生频率较高，提示结直肠腺癌在分化程度逐步降低时可能出现了K-ras基因从12密码子向13密码子突变转化的过程。由于肿瘤分化程度被普遍认为与分期、复发、转移等预后因素密切相关，但能否认为K-ras基因第13位密码子突变状态的存在是预后不良的相关因素之一，仍需扩大样本量进一步研究。

综上所述，K-ras基因是EGFR信号通路中最易发生突变的基因，并且在结直肠癌的发生、发展、转移等各个阶段起重要作用。深入研究K-ras基因的结构、功能及突变规律对结直肠癌的防治具有重要意义。

参考文献:

［1］Shigenori K，Miho K，Shuhei T，et al.Prognostic value of KRAS and BRAFmutations in curatively resected colorectal cancer［J］.World Gastroenterology，2015，9(4): 1275-1283.

［2］Lea IA，JacksonmA，Li X，et al.Genetic pathways andmutation profiles of human cancers: site and exposure specific patterns［J］.Carcinogenesis，2007，28(9): 1851-1858.

［3］Ju Y，Yan L，Yun Q，et al.KRAS and BRAF genemutations anddNAmismatch repair status in Chinese colorectal carcinoma patients［J］.World Gastroenterology，2015，21(5): 1595-1605.

［4］Soeda H，Shimodaira H，Gamohm，et al.PhaseⅡTrial of Cetuximab plus Irinotecan for Oxaliplatin- and Irinotecan-Based Chemotherapy-Refractory Patients with Advanced and/ormetastatic Colorectal Cancer: Evaluation of Efficacy and Safety Based on KRASmutation Status(T-CORE0801)［J］.Oncology，2014，1:7-8.

［5］徐向明，张国良，李敏伟，等.结直肠癌组织中K-ras基因的检测及其意义［J］.中华医学杂志，2010，90(18): 1268-1271.

［6］Frattinim，Saletti P，Romagnani E，et al.PTEN loss of expression predicts cetuximab efficacy inmetastatic colorectal cancer patients ［J］.Brit J Cancer，2007，97(8): 1139-1145.

［7］Chun L，Jen L，Tzu L，et al.The prognostic role ofmicrosatellite instability，codon-specific KRAS，and BRAFmutations in colon cancer［J］.Surgical Oncology，2014，110(4): 451-457.

［8］Calistrid，Rengueci C，Seymour I，et al.Mutation analysis of p53，K-ras，and BRAF genes in colorectal cancer progression［J］.J Cell Physiol，2005，204(2): 484-488.

［9］Nur S，Yu F，Daniel L，et al.Non-invasive sensitivedetection of KRAS and BRAFmutation in circulating tumor cells of colorectal cancer patients［J］.Molecular Oncology，2015，9(4): 850-860.

［10］吴伟，胡锦林，鞠海星，等.散发性大肠癌K-ras基因点突变研究及其临床病理意义［J］.医学研究杂志，2010，39(12): 53-57.

［11］吴文辉，肖隆斌，汤友珍，等.K-ras基因突变与结直肠癌生物学行为的关系［J］.中国病理生理杂志，2009，25(11): 2159-2162.

［12］Conlin A，Smith G，Carey FA，et al.The prognostic significance of K-ras，p53，and APCmutations in colorectal carcinoma［J］.Gut，2005，54(9): 1283-1286.

［13］Pierre P，Deniz P，Corinne N，et al.Clinical Relevance of KRASMutated Subclonesdetected with Picodropletdigital PCR in Advanced Colorectal Cancer Treated with Anti-EGFR Therapy［J］.Clinical cancer research，2015，21(5): 1087-1097.

收稿日期:( 2015-07-04)

通信作者简介:孙锁柱(1968-)，男，主任医师，研究方向为诊断病理学。E-mail:mingzhu0368@ sina.com

作者简介:第一刘珊(1980-)，女，博士研究生，主治医师，研究方向为分子病理学。E-mail: iceicequeen@ sina.com

基金项目:国家自然科学基金青年基金资助项目(8301662)。

文章编号:1002-266X(2015)36-0001-03

文献标志码:A

中图分类号:R735.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.001