酪酸杆菌对水浸小鼠应激性胃溃疡的防治效果观察

徐敏，黄珏玮，付瑶阳，张浩，方思维，郭雷，王方岩(温州医科大学基础医学院，浙江温州505;温州医科大学第一临床医学院; 温州医科大学第二临床医学院)

酪酸杆菌对水浸小鼠应激性胃溃疡的防治效果观察

徐敏1，黄珏玮2，付瑶阳1，张浩1，方思维3，郭雷2，王方岩1
(1温州医科大学基础医学院，浙江温州325035;2温州医科大学第一临床医学院; 3温州医科大学第二临床医学院)

摘要:目的探讨酪酸杆菌对水浸应激性胃溃疡的预防治疗作用及机制。方法将30只ICR小鼠随机分为正常组、模型组、酪酸杆菌组各10只。酪酸杆菌组予酪酸杆菌菌液0.4mL(5×108cfu)灌胃，1次/d，连续5天。末次灌胃后饥饿24 h，模型组与酪酸杆菌组采用束缚水浸应激法制作小鼠胃溃疡模型。造模结束后颈椎脱臼处死小鼠，测定溃疡面积并计算溃疡面积百分率;采用HE染色法观察各组胃黏膜组织损伤程度;免疫组化法检测各组增殖细胞核抗原(PCNA)表达;硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法分别检测胃组织丙二醛(MDA)和超氧物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)。结果与模型组比较，酪酸杆菌组溃疡面积明显下降(P＜0.01);胃黏膜组织病理变化较轻;胃黏膜层细胞PCNA表达量显著增加;胃组织MDA含量下降，SOD、CAT活性明显提高(P均＜0.01)。结论酪酸杆菌可能通过减轻机体氧化应激反应，促进胃黏膜细胞增殖，减小溃疡面积，减轻胃部病理变化，对水浸应激性胃溃疡发挥明显的防治作用。

关键词:胃溃疡;抗溃疡药;酪酸杆菌;防治作用;氧化应激;水浸

应激性胃溃疡指当机体遭遇各种强烈的有害刺激时引起的胃黏膜急性溃疡及糜烂;其并发症有出血、穿孔、幽门梗阻甚至癌变，若不及时治疗，可导致死亡［1］。酪酸杆菌在治疗肠道疾病方面已有几十年的临床应用历史，疗效颇佳，但其在胃溃疡方面的研究少有涉及［2］。酪酸杆菌主要代谢产物为丁酸和氢气，丁酸是肠黏膜再生和修复的重要营养物质，而氢气具有广谱的抗炎作用，同时对应激性胃溃疡也具有治疗作用［3～5］。2012年4月～2013年5月，我们观察了酪酸杆菌对小鼠水浸应激性胃溃疡的预防治疗效果，现分析结果，探讨其作用机制。

1　材料与方法

1.1材料本实验室保藏酪酸杆菌株(CGMCC NO.8808); SPF级雄性ICR小鼠30只，体质量(25 ±2)g，购自温州医科大学实验动物中心; BCA蛋白定量试剂盒，丙二醛(MDA)测定试剂盒(碧云天生物技术研究所);超氧物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所); TPY液体培养基(青岛海博生物技术有限公司);增殖细胞核抗原(PCNA)抗体(北京博澳森生物技术有限公司)。

1.2酪酸杆菌活化与传代取适量酪酸杆菌活菌充分溶于5mL TPY培养基中，活化后将培养基置于37℃厌氧培养箱中培养20 h。按4%的接种量接种传代，至第三代活性最高，可用以灌胃治疗。

1.3胃溃疡模型制作与干预将30只小鼠随机分为正常组、模型组和酪酸杆菌组各10只。酪酸杆菌组予酪酸杆菌菌液0.4mL(5×108cfu)灌胃，1次/d，连续5天。正常组给予TPY培养基0.4mL灌胃，1 次/d，连续5天。末次灌胃后饥饿24 h，模型组和酪酸杆菌组制作应激性胃溃疡模型:戊巴比妥钠0.15mL/10 g腹腔麻醉。将小鼠固定牢固，待其清醒后将其浸入(23±0.5)℃的水中8 h，水浸至剑突部。

1.4相关指标观察

1.4.1溃疡面积造模结束后，颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔，4只胃结扎幽门和贲门，向胃内注入20%甲醛溶液后取下，并放入盛有10%甲醛溶液的烧杯中，静置10min后取出沿胃大弯剖开，展开胃，用滤纸缓缓吸干水分，观察胃溃疡状况，进行扫描后再利用软件Image-Pro Plus 6.0测量的数据计算出溃疡面积百分率。溃疡面积百分率=(溃疡面积/胃总面

积)×100%。其他胃组织取下并在冰生理盐水中轻轻涮洗，储存于液氮中，用于生化指标检测。

1.4.2胃黏膜组织病理学变化采用HE染色法。将甲醛固定的胃进行石蜡包埋，切片机切片，HE染色。将切片脱蜡水化后，放入苏木素染色45 s，再用流水稍洗数秒。随后用1%盐酸乙醇分化切片，PBS缓冲液返蓝，再将切片用伊红染色，流水稍洗较长时间后进行乙醇脱水，二甲苯透明，最后滴上中性树胶进行封片。HE染色后的病理切片制作完成后，镜检观察胃黏膜病理学变化。

1.4.3胃黏膜组织PCNA表达采用免疫组化法。将甲醛固定的胃进行石蜡包埋，切片机切片。将切片用进行常规免疫组化反应。免疫组化后的切片镜检观察胃组织细胞PCNA抗体表达情况。根据参考文献［6］确定PCNA表达及阳性判断标准。

1.4.4胃黏膜组织MDA含量及SOD、CAT活性测定采用硫代巴比妥酸法。取胃组织匀浆液，加样、比色，各种试剂按试剂盒要求配制，按顺序依次加入试剂及样品，充分混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，100℃水浴15min，取出后流水冷却，1 000 r/min离心10min，取上清液于532 nm处测各管吸光度值。根据标准曲线计算获得MDA的摩尔浓度(μmol/gprot)。SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法。取胃组织匀浆液，加样、比色，试剂按试剂盒要求配制，按顺序依次加入试剂及样品，充分混匀，置37℃恒温水浴40min后加显色剂，混匀，室温放置10min，于波长550 nm处，蒸馏水调零，比色，测各管吸光度(OD)值。SOD活力(U/mL)=(对照管OD值－测定管OD值)/对照管OD值/ 50%×(反应液总体积/取样量)。CAT活性测定原理: CAT分解H2O2的反应可通过钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生淡黄色的络合物，在405 nm处测定生成量，利用对照管和测定管的吸光度差异即可求出每毫克蛋白CAT活力(U/mg prot)。步骤:取胃组织匀浆液进行测定，加样、比色;各种试剂按试剂盒要求配制，按顺序和分组依次加入试剂及样品，混匀后于波长405 nm处，蒸馏水调零，测各管OD值。CAT活力(U/mgprot)=(对照管OD值－测定管OD值)×271/(60×取样量)/待测样本蛋白浓度。

1.5统计学方法采用SPSS19.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1溃疡面积及百分率正常胃黏膜标本无出血斑点。模型组胃黏膜可见片状出血灶，部分黏膜脱落，上附有深黑色血痂。酪酸杆菌组胃黏膜局部皱缩，分布有少量点状出血灶，上附有浅棕色血痂。见插页Ⅰ图3。酪酸杆菌组及模型组溃疡面积百分率分别为21.75%±6.47%和84.63%±18.75%，两组比较P＜0.01。

2.2胃黏膜组织病理学变化正常组胃黏膜结构正常，清晰完整。模型组胃壁四层结构层次清楚，上皮不完整，局部腺体结构紊乱，腺腔内较多脱落的上皮细胞碎片，胞质染色浅，可见透明环状空晕;黏膜表层可见多处带状缺损。酪酸杆菌组胃上皮缺损范围小，腺体排列较整齐，其中酪酸杆菌组上皮深层结构完整、连续。见插页Ⅰ图4。

2.3胃黏膜组织PCNA表达光镜下观察，正常组胃组织黏膜层细胞可见PCNA表达，呈强阳性。模型组胃组织黏膜层细胞PCNA几乎无表达，酪酸杆菌组胃组织黏膜层细胞PCNA的表达与模型组比较则显著增加，呈现强阳性。见插页Ⅰ图5。

2.4mDA含量及SOD、CAT活力各组MDA含量及SOD、CAT活性比较见表1。

表1　各组MDA含量及SOD、CAT活性比较()

表1　各组MDA含量及SOD、CAT活性比较()

注:与模型组比较，*P＜0.01。

组别　nmDA(μmol/g)SOD(U/mgprot)CAT(U/mgprot)正常组6　0.64±0.05　88.26±6.85　3.52±0.21模型组　6　2.90±0.48　34.07±5.50　1.44±0.14酪酸杆菌组　6　1.60±0.12*　51.67±2.55*　2.30±0.72*

3　讨论

水浸应激性胃溃疡是由于受到应激性刺激，交感神经兴奋，血管收缩，引起黏膜缺血、缺氧、抵抗力下降;同时副交感神经-垂体-肾上腺系统兴奋性增高，引起胃酸、胃蛋白酶和胃泌素分泌增加所致［1，5，6］。在应激状态下，由于损伤因素的刺激和保护机制的减弱，可出现下丘脑调控垂体等内分泌腺体功能障碍、胃黏膜微循环障碍、壁细胞激活、胃黏膜屏障受损、迷走神经兴奋性异常增高、胃黏膜内脂质过氧化物含量升高和氧自由基产生增加等多方面的变化，最终导致溃疡的发生和发展［6］。本研究中采用的束缚水浸应激法能在较短时间内诱导胃溃疡，这一模型已被广泛用以研究应激性胃溃疡的发生机制以及治疗药物的筛选等方面。

本研究结果表明，与模型组比较，酪酸杆菌组溃疡面积明显减小，证实酪酸杆菌可减小溃疡面积，提高溃疡抑制率。酪酸杆菌组胃溃疡黏膜组织病理变化明显轻于模型组，证实酪酸杆菌对胃黏膜有保护作用。PCNA为反映细胞增殖情况的指标，能够判断胃黏膜的损伤与修复情况。本研究通过免疫组化

发现，正常组胃组织黏膜层细胞可见PCNA表达，呈强阳性;模型组胃组织黏膜层细胞几乎无PCNA表达，酪酸杆菌组胃组织黏膜层细胞PCNA的表达与模型组比较则显著增加，呈现强阳性。提示酪酸杆菌对小鼠胃组织的修复再生有促进作用。MDA是机体脂质氧化的产物，其含量可间接反映机体受损伤程度。SOD、CAT是机体内的抗氧化酶体系，在正常情况下，由于机体内含有SOD、CAT等自由基清除剂，使自由基得以及时清除，机体仅有少量自由基存在，这种氧化与抗氧化系统保持着动态平衡，使机体免受危害，SOD、CAT活性可反映机体清除自由基的能力［7］。本研究结果显示，酪酸杆菌组MDA明显低于模型组，SOD和CAT活性明显高于模型组，证实酪酸杆菌可减少MDA的生成，减轻氧化应激反应，以上结果进一步证明了酪酸杆菌对水浸应激性胃溃疡具有良好的防治作用。

综上所述，酪酸杆菌对水浸应激性胃溃疡有一定的防治作用;其机制可能与减轻机体内氧化应激反应有关。本研究为应激性胃溃疡的临床治疗及用药提供了实验依据。

参考文献:

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收稿日期:( 2014-09-14)

通信作者:王方岩，E-mail: wzyxywfy@126.com

基金项目:温州市科技局项目(Y20130215);浙江省新苗计划项目(2014R413032)。

文章编号:1002-266X(2015)36-0024-03

文献标志码:A

中图分类号:R573.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.008