SIRT1在NMDA诱导的皮层神经元凋亡中的作用观察

卫美辰，杨小荣

SIRT1在NMDA诱导的皮层神经元凋亡中的作用观察

卫美辰，杨小荣

摘要：目的观察沉默信息调节因子(silent information regulator 1，SIRT1)在NMDA诱导的大鼠皮层神经元凋亡中的作用。方法培养大鼠原代皮层神经元，给予NMDA(100 μmol/L，2 h)建立兴奋性神经毒模型；应用Caspase-3活性分析和Annexin V染色方法，检测细胞凋亡。结果SIRT1激活剂白藜芦醇(Resveratrol，RSV)拮抗NMDA引起的细胞凋亡，而SIRT1抑制剂Sirtinol(10 μmol/L)取消RSV(25 μmol/L)的保护作用。结论在NMDA诱导的细胞凋亡过程中，激活SIRT1发挥保护作用，而抑制SIRT1则参与神经损伤。

关键词：沉默信息调节因子1；NMDA；细胞凋亡；神经保护

NMDA诱导的兴奋性神经毒造成神经损伤，并导致神经细胞的死亡，早期认为主要以坏死为主。NMDA也可通过引起凋亡参与兴奋性神经毒引起的神经元死亡[1]。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)作为NAD+依赖的脱乙酰基酶，通过对组蛋白及多种非组蛋白的去乙酰化修饰，参与基因转录、能量代谢以及细胞衰老过程的调节[2，3]。近年研究发现，SIRT1具有明显的神经保护作用。但SIRT1对NMDA诱导的皮层神经元凋亡是否发挥保护作用尚不明确。

本研究采用NMDA(100 μmol/L，2 h)兴奋毒细胞模型诱导细胞凋亡，应用Caspase-3活性分析和Annexin V染色方法检测细胞凋亡，通过给予SIRT1激活剂白藜芦醇(Resveratrol，RSV)和/或 SIRT1抑制剂Sirtinol，观察SIRT1在NMDA诱导的皮层神经元凋亡中的作用。

1材料与方法

1.1试剂Neurobasal和B27添加剂购自Gibco，Caspase-3活性检测试剂盒购自Abcam，guava Nexin试剂盒购自Guava，RSV和Sirtinol购自Sigma。

1.2方法

1.2.1细胞培养取新生1 d～3 d的大鼠，常规手术，分离制成大鼠皮层单细胞悬液。细胞悬液经1 000 g离心5 min，弃上清，用培养液重悬细胞，按5×104个/mL的浓度，在37 ℃、5%CO2的条件下进行培养。

2结果

2.1SIRT1在NMDA引起Caspase-3活性增高中的作用预先应用SIRT1抑制剂Sirtinol(10 μmol/L)与神经元预孵育2 h，之后加入SIRT1激活剂RSV(25 μmol/L)再孵育12 h，采用Caspase-3活性测定细胞凋亡。结果显示，RSV可以有效抑制NMDA引起的Caspase-3活性增高，使Caspase-3活性降低33.63%(P<0.05)；Sirtinol可以有效阻断RSV的作用；NMDA受体拮抗剂MK-801完全阻断NMDA的作用。详见图1。

图1　SIRT1在NMDA引起Caspase-3活性增高的作用

2.2SIRT1在NMDA引起细胞凋亡中的作用Annexin-V染色结果显示，用RSV预处理后，NMDA诱导的细胞早期凋亡和晚期凋亡比例分别降低了22.9%和72.1%；而Sirtinol拮抗了这种作用；MK-801完全阻断NMDA的作用。详见图2。

图2　SIRT1在NMDA引起细胞凋亡中的作用

3讨论

谷氨酸作为中枢神经系统一种重要的神经递质，当在突触间隙中过度积聚时，可以激活突触后膜NMDA受体，使胞外Ca2+内流，激活多种蛋白酶，过度产生自由基。这些因素共同作用，引起神经元损伤甚至死亡，产生兴奋性神经毒效应[4]。越来越多的证据表明，NMDA诱导的神经细胞死亡是一个完善且有效的神经损伤模型，它是引起多种神经退行性疾病的一种重要发病机制[5]。

SIRT1是在哺乳动物中首先被发现的Sirtuin去乙酰化酶家族成员，也是目前研究最多、最为深入的Sirtuin蛋白。现有研究已证实SIRT1在脑缺血、AD、HD和PD等多种神经损伤模型中具有明显的保护效应[6-8]。但SIRT1在NMDA诱导的皮层神经细胞凋亡中是否发挥保护作用尚不明确。

本实验结果显示，SIRT1激动剂RSV能够拮抗NMDA诱导的神经细胞凋亡，表现为使NMDA诱导的Caspase-3活性降低，细胞凋亡减少；而SIRT1抑制剂Sirtinol能够阻断RSV对NMDA损伤的拮抗效应，说明RSV 的保护作用是通过活化SIRT1而实现的。因此，在NMDA诱导的细胞凋亡过程中，激活SIRT1发挥保护作用，而抑制SIRT1则参与神经损伤。

SIRT1作为一种去乙酰化酶，可以作用于P53、NF-κB、PGC-1α、LKB1、TSC2、HSF1等多种底物使其发生去乙酰化，参与多种损伤过程的调节。相关研究显示，SIRT1可以通过去乙酰化凋亡激活蛋白FOXOs来抑制其转录，使神经元细胞免于凋亡[9]；SIRT1通过使HSF1(heat shock factor 1，HSF1)去乙酰化，促进HSF1与Hsp70启动子结合，激活Hsp70，减少细胞凋亡[10]。

SIRT1可能通过其去乙酰化作用调节多种转录调节因子的活性，从而对各种神经损伤发挥保护作用。

参考文献：

[1]Mattson MP.Apoptosis in neurodegenerative disorders[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2000，1(2)： 120-129.

[2]Haigis MC，Guarente LP.Mammalian sirtuins emerging roles in physiology，aging，and calorie restriction[J].Genes Dev，2006，20(21)： 2913-2921.

[3]Bordone L，Guarente L，Calorie restriction，SIRT1 and metabolism：Understanding longevity[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6(4)： 298-305.

[4]Hynd MR，Scott HL，Dodd PR.Glutamate-mediated excitotoxicity and neurodegeneration in Alzheimer’s disease[J].Neurochem Int，2004，45(5)： 583-595.

[5]Beal MF.Role of excitotoxicity in human neurological disease[J].Curr Opin Neurobiol，1992，2(5)： 657-662.

[6]Wang P，Xu TY，Guan YF，et al.Nicotinamide phosphoribosyltransferase protects against ischemic stroke through SIRT1-dependent adenosine monophosphate-activated kinase pathway[J].Ann Neurol，2011，69(2)： 360-374.

[7]Jiang M，Wang J，Fu J，et al.Neuroprotective role of Sirt1 in mammalian models of Huntington’s disease through activation of multiple Sirt1 targets[J].Nat Med，2012，18(1)： 153-158.

[8]Xiao G，Hu W，Chen X.Magnesium lithospermate B protects neurons from N-methyl-D-aspartic acid injury and attenuates kainic acid-induced neurodegeration in FVB mice[J].J Mol Neurosci，2013，51(2)： 550-557.

[9]Anekonda TS，Reddy PH.Neuronal protection by sirtuins in Alzheimer’s disease[J].J Neurochem，2006，96(2)： 305-313.

[10]Donmez G，Arun A，Chung CY，et al.SIRT1 protects against alpha-synuclein aggregation by activating molecular chaperones[J].J Neurosci，2012，32(1)： 124-132.

(本文编辑王雅洁)·综述与进展·

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收稿日期：(2014-07-22)

通讯作者：杨小荣，E-mail：842904087@qq.com

中图分类号：R338R285

文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2015.13.009

文章编号：1672-1349(2015)13-1498-02

作者单位：山西医科大学(太原 030001)

1.2.2NMDA毒性诱导将培养神经元在NMDA(100 μmol/L)和Gly(10 μmol/L)溶液中孵育2 h，再进行后续的细胞凋亡检测。SIRT1激活剂RSV在NMDA诱导之前预孵育12 h，SIRT1抑制剂Sirtinol在RSV孵育前2 h加入。

1.2.3Caspase-3活性测定将细胞接种在96孔板中，在NMDA作用后的20 h，用Caspase-3检测试剂盒测定细胞的Caspase-3活性。在PBS中漂洗、收集细胞；在50 μL细胞裂解液中孵育细胞10 min后，再离心5 min(10 000 g)。取上清测定蛋白浓度，将每个蛋白样品(50 μg～200 μg)稀释至50 μL细胞裂解液中；将50 μL的2×反应缓冲液(含10 mmol / L的DTT)加入各样品中；再加入5 μL的DEVD-pNA(4 mmol / L)底物溶液，并在37 ℃作用1.5 h；最后在(400～405)nm处测定OD值。

1.2.4Annexin-V染色将细胞接种在96孔板中，在NMDA作用后的24 h，用Annexin-V染色方法检测细胞凋亡。在PBS中收集、重悬细胞；在100 μL细胞悬浮液中加入100 μL 的Nexin试剂，室温避光反应20 min；通过Guava系统获得细胞样品。活细胞(Annexin V-/7-AAD- )、早期凋亡细胞(Annexin V+/7-AAD-)、晚期凋亡/死亡细胞(Annexin V+/7-AAD+)和核碎片(AnnexinV/7-AAD+)分布的百分比用Guava Nexin软件进行分析。