五藤胶囊的薄层色谱定性鉴别及其补骨脂素HPLC定量研究

李万红

海安县中医院，江苏 海安 226600

五藤胶囊由鸡血藤、青风藤、海风藤、石楠藤、络石藤、补骨脂等药物组成，具有祛风通络、温经壮骨功效，对各类关节疾病有良好的治疗效果。本文采用薄层色谱法对鸡血藤［1-2］、青风藤［3］、补骨脂等进行定性鉴别［4］，并采用HPLC法对五藤胶囊内容物中补骨脂素进行定量分析，为本品的质量控制提供实验依据。

1 薄层色谱定性鉴别

1.1 材料 鸡血藤、海风藤、补骨脂、威灵仙等(购自南通三越中药饮片有限公司，经陈峰生主任中药师鉴定)；五藤胶囊 (海安县中医院，批号：111228，120420，120711)；芒丙花素、青藤碱、补骨脂素(供定性鉴别用，购自中国药品生物制品检定所)。

1.2 仪器 PBQ-Ⅰ型自动铺板器(重庆南岸动力仪器厂)，HH4数显恒温水浴锅 (常州国华电器有限公司)，紫外透射反射仪(北京六一仪器厂)，数码相机(英国)，KQ-500超声波清洗器(上海超声波仪器厂)等。

1.3 试剂 正己烷、石油醚(60～90℃)、无水乙醇、正丁醇、甲苯、苯、乙酸乙酯、甲醇、乙醚、三氯甲烷、碘化铋钾、亚硝酸钠等，均为分析纯。

1.4 薄层板的制备

1.4.1 硅胶G CMC-Na板的制备 取硅胶G75g，加0.5%CMC-Na溶液180mL，调成糊状，用自动铺板器铺成4mm厚薄板，置水平桌面上通风阴干后，110℃活化30分钟，备用。

1.4.2 氢氧化钠-硅胶G板的制备 取硅胶G 60 g，加入含2%氢氧化钠的0.5%CMC-Na溶液150mL，调成糊状，用自动铺板器铺成4mm厚的薄层板，置水平桌面上通风晾干后，110℃活化30分钟，备用。

1.5 薄层色谱鉴别［5］

1.5.1 鸡血藤

1.5.1.1 对照品溶液的配制 取芒丙花素对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。

1.5.1.2 供试品溶液的制备 取本品粉末1 g，加入乙醇100mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，加入1 g硅胶拌匀，挥干溶剂，置硅胶柱中(2 g，内径 1.0 cm，100～200目，干法装柱)，依次使用石油醚(60～90℃)30mL、甲醇-三氯甲烷(1∶9)40mL洗脱，收集甲醇-三氯甲烷(1∶9)洗脱液，蒸干，残渣加0.5mL三氯甲烷使溶解，作为供试品溶液。

1.5.1.2 对照药材溶液的制备 取鸡血藤药材1 g，同上述供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。

1.5.1.3 阴性供试品溶液的制备 据处方比例量，取除鸡血藤外的其余药味按工艺要求制成缺鸡血藤的样品，按供试品溶液制备方法，制备阴性供试品溶液。

1.5.1.4 点样、展开 照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取上述供试品溶液10μL、对照品溶液5μL分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(20∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。

1.5.1.4 显色与结果 置紫外光灯 (254 nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。结果见图1。

图1 鸡血藤TLC鉴别图谱

1.5.2 青风藤

1.5.2.1 对照品溶液的制备 取青藤碱对照品，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。

1.5.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末2 g，加乙醇25mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。

1.5.2.3 对照药材溶液的制备 取青风藤药材粉末约1 g，依上述供试品溶液制备方法制备药材对照液。

1.5.2.4 阴性供试品溶液的制备 据处方比例量，取除青风藤外的其余药味按工艺要求制成缺青风藤的样品，按供试品溶液制备方法，制备阴性供试品溶液。

1.5.2.5 点样、展开 照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取上述溶液各5μL，分别点于同一用2%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯 -甲醇 -水(2∶4∶2∶1)10℃以下放置的上层溶液为展开剂，置浓氨试液预饱和20分钟的展开缸内，展开，取出，晾干。

1.5.2.6 显色与结果 依次喷以碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果见图2。

图2 青风藤TLC鉴别图谱

1.5.3 补骨脂

1.5.3.1 对照品溶液的制备 取补骨脂素对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。

1.5.3.2 供试品溶液的制备 取本品药粉5 g，加石油醚(60～90℃)50mL，回流 30分钟，滤过，取药渣挥去石油醚，加乙酸乙酯50mL，回流30分钟，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。

1.5.3.3 对照药材溶液的制备 取补骨脂药材粉末约0.5 g，加乙酸乙酯20mL，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为对照药材溶液。

1.5.3.4 阴性供试品溶液的制备 据处方比例量，取除补骨脂外的其余药味按工艺要求制成缺补骨脂的样品，按供试品溶液制备方法，制备阴性供试品溶液。

1.5.3.5 点样、展开 照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取上述溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。

1.5.3.6 显色与结果 喷以10%氢氧化钾甲醇溶液，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝白色荧光斑点。结果见图3。

图3 补骨脂TLC鉴别图谱

2 补骨脂素的含量测定

2.1 实验材料与实验仪器 五藤胶囊(海安县中医院，批号：111228，120420，120711)；补骨脂素对照品 (中国药品生物制品检定所，批号：110766-200414)；甲醇、乙腈(色谱纯)，超纯水(自制)，其余试剂均为分析纯。Agi lent 1100高效液相色谱仪；VWD紫外检测器；AET-40SM型1/10万电子天平(日本Shimad公司)；UV-2401型紫外分光光度计(日本岛津公司)。

2.2 色谱条件 色谱柱：Kromasi l C18柱 (250×4.6 mm)；流动相的选择；经预试验，以甲醇-乙腈-1%乙酸(15∶25∶60)作为流动相，测定波长为246 nm，补骨脂素峰与杂质峰分离度较好。流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；灵敏度：AUFS=1.0。系统试验适应性研究：在上述条件下测定样品中补骨脂素的含量，以补骨脂素峰计算理论板数应不低于3 000。

2.3 对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称定补骨脂素对照品0.294mg，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得浓度为29.40μg/mL的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 取五藤胶囊内容物适量，精密称定约0.5 g，置索氏提取器中，加甲醇适量，加热回流提取2小时，放冷，转移至100mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，作为供试品溶液。

2.3.3 阴性供试品溶液的制备 据处方比例量，取除补骨脂外的其余药味按工艺要求制成缺补骨脂的阴性供试品，再按供试品溶液制备方法，制备阴性供试品溶液。

2.4 空白试验 精密吸取对照品溶液、阴性供试品溶液、供试品溶液各10μL注入液相色谱仪。结果表明处方中其它药材对补骨脂素测定无干扰。结果见图4—6。

图4 补骨脂素对照品HPLC色谱图

图5 补骨脂阴性供试品HPLC色谱图

图6 五藤胶囊中补骨脂素的HPLC色谱图

2.5 补骨脂素线性关系考察 精密称取补骨脂素对照品7.35 mg，置25 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得补骨脂素对照品储备液（浓度为294μg/mL）。再依次分别精密吸取对照品储备液 0.4、1、1.6、2.2、2.8mL置 10mL容量瓶中，分别加甲醇稀释至刻度，即得浓度为11.76、29.40、47.04、64.68、82.32μg/mL的对照品溶液。依次吸取上述对照品溶液各20μL进样，测定峰面积。以进样补骨脂素质量为横坐标，以峰面积的积分值为纵坐标，绘制标注曲线，回归方程为 y=42.194x+0.408，r=0.999 9，线性范围：11.76～82.32μg/mL。结果见表1与图7。

表1 补骨脂素标准曲线的测定数据

图7 补骨脂素标准曲线

2.6 精密度实验 精密吸取的补骨脂素对照品溶液（浓度为 47.04μg/mL）20μL，重复进样 6次，测得峰面积，计算RSD值为1.03%。结果见表2。

表2 补骨脂素精密度实验结果

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液每隔一段时间进样1次，每次20μL，测定峰面积，结果表明样品溶液在8小时内稳定，结果见表3。

表3 补骨脂素稳定性试验结果

2.8 重复性实验 取批号为120420的胶囊，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，平行试验6份，进样20μL，测定峰面积，结果见表4。

表4 补骨脂素重复性试验结果(n=6)

2.9 回收率实验 精密称取已知补骨脂素含量为3.62 mg/g的五藤胶囊(批号：120420)粉末5份，每份约80mg，分别加入浓度为29.4μg/mL的补骨脂素标准溶液 8、8、10、10、15mL，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，进样，测定峰面积。平均回收率为99.75%，RSD值为1.09%。结果见表5。

2.10 样品含量测定 分别精密称取3个批号五藤胶囊的内容物，每份约0.5 g，按供试品溶液的制备方法制备，进样20μL，依法测定，结果见表6。

根据测定结果，暂定五藤胶囊内容物中补骨脂素含量不得低于3mg/g。

表5 补骨脂素回收率试验结果

表6 样品中补骨脂素含量测定结果

3 讨论

五藤胶囊以鸡血藤、青风藤、海风藤、石楠藤、络石藤等5味茎(藤)木类中药为主药，共奏祛风湿、通经络、蠲痹痛之功，具抗炎、镇痛、免疫抑制作用；制川乌、制草乌、干姜、细辛祛风通络，温经止痛，亦具抗炎、免疫作用；豨莶草、威灵仙祛风化湿；全蝎、僵蚕、乌梢蛇熄风止痉，祛风活血，能辅助主药增强祛风通络作用；生地黄性味甘寒，可抑制诸药燥热之性，生地黄本身也具有抗炎和促进免疫作用；鹿角霜、补骨脂温肾助阳兼治因风湿性疾病引起的骨代谢紊乱。诸药合用具有祛风通络、温经壮骨的功效，可用于治疗类风湿性关节炎、风湿性关节炎、增生性关节炎等，尤其用于治疗强直性脊柱炎取得令人满意的效果［6］。

对五藤胶囊的主要成份用薄层色谱定性鉴别和采用HPLC法对胶囊内容物主要指标成份进行定量分析。方法先进，重现性、可行性好［7-8］，为五藤胶囊的质量控制提供依据。本方经本院临床使用，疗效确切，深受患者欢迎。本品其他组份的定性定量分析方法有待进一探讨。

［1］ 郭希庆.鸡血藤糖浆中芒丙花素含量的高效液相色谱法测定［J］.时珍国医国药，2013，24(11):2657-2658.

［2］ 李正翔，杨静，李彬，等.通脉丸质量标准的研究［J］.中国现代应用药学杂志，2004，21(4):297-300.

［3］ 陈勇，邓家刚，王勤，等.抗痛风颗粒中青风藤TLC鉴别与青藤碱的含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2007，13(6):11-13.

［4］ 宗淑梅，薛贵平，张翠双，等.补骨脂中补骨脂素含量的高效液相色谱法测定［J］.时珍国医国药，2012，23(12):2993-2994.

［5］ 国家药典委员.中华人民共和国药典(一部)［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：174-181.

［6］ 陈高萍.溶石胶囊的质量标准研究［J］.长春中医药大学学报，2012，28(1):155-156.

［7］ 周国莉，林晓莲，程聪.HPLC法测定裸花紫珠片中木犀草素的含量［J］.长春中医药大学学报，2010，26(3):437-439.

［8］ 邓开英.HPLC测定更年平胶囊中补骨脂素和异补骨脂素的含量［J］.中成药，2001，23(9)：643-645.