当归含药血清对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的保护作用研究

谢守嫔 ，罗 佳 ，李海龙 ，吴红彦 △

1兰州市第一人民医院，甘肃 兰州 730050；2兰州市中医医院；3甘肃中医药大学;4甘肃省中药新产品创制工程实验室

当归是已广泛使用的药物，当归及其提取物在实验研究中也体现出对Aβ诱导的神经毒性有保护作用，但对Aβ诱导的神经细胞凋亡却未见报道。因而，本实验拟以Aβ25-35诱导PC12细胞复制阿尔茨海默病细胞模型为对象，采用具有养血、活血、调肝的当归含药血清以不同浓度加以干预，从细胞活力、细胞膜的损伤和细胞凋亡的变化入手，探索其药理机制，为进一步筛选当归有效组份提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞 SPF级Wistar大鼠40只，雌雄各半，体质量(300±20)g，由甘肃中医学院科研实验动物中心提供，动物质量合格证编号：SCXK(甘)2004-0006-0000994，实验设施使用许可证编号：SYXK(甘)2004-0006-0000308。动物分笼饲养，食固体饲料，饲料由甘肃中医药大学科研实验动物中心提供，食水自由，室温20～25℃，相对湿度45%～52%。PC12细胞(中分化)购于中国科学院上海细胞库。

1.2 实验药品与试剂 中药材当归：购于甘肃兰州老字号“复兴厚”药材公司；DMEM：Sigma公司，批号：NVL0337。细胞培养液：将DMEM培养基中加入10%胎牛血清和1%双抗，0.22μm滤器过滤除菌，PH 7.2～7.4，4℃保存。磷酸盐缓冲液(PBS)：购于gibico公司，批号：20101025；用双蒸水定容至1 000 mL，0.22μm滤器过滤除菌，PH为 7.2～7.4，4℃保存。Hanks：Solarbio，批号：H1025。胎牛血清：杭州四季青公司，批号：100528；56℃灭活30分钟，无菌分装，-20℃保存，使用前经4℃、室温、37℃缓慢溶解备用。胰蛋白酶：购于鹏程公司，批号：0458；用PBS液配制成浓度为0.25%溶液，0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存。四氮唑蓝(MTT)：购于鹏程生物工程公司，批号：0793；用pH为7.4的PBS溶解，用时配成终浓度5 mg/mL的溶液，4℃避光保存。二甲基亚砜(DMSO)：购于鹏程公司。LDH试剂盒：购于南京建成生物工程研究所，批号：20101025。Aβ25-35：sigma公司，批号：108k4794。Anncxin V/PI试剂盒：杭州联科生物公司，批号：JK100929。

1.3 Aβ配制方法 将1mg Aβ25-35溶解于BPS液中，配制成浓度为1mmol／L母液。储存于-30℃冰箱中备用。使用时将其稀释至100μmol/L，并置于37℃，5%CO2培养箱中3～7天以增强其毒性。

1.4 细胞培养 PC12细胞株完全培养液为DMEM+10%(体积比)胎牛血清+青链霉素，5%CO2、37℃培养箱中培养。每3～4天传代1次。倒置显微镜观察细胞生长情况。

1.5 实验分组 正常组：只加细胞悬液，不加任何处理因素；模型组：取20μmol/L终浓度的A β25-3530μL处理细胞24小时；空白血清组：用空白血清组加入空白血清30μL预处理24小时后加入20μmol/L终浓度Aβ25-3530μL共同孵育24小时；药物组：当归10倍(当归高剂量组)，5倍(当归中剂量组)，正常剂量(当归小剂量组)3组含药血清30μL预处理24小时后加入20μmol/L终浓度Aβ25-3530μL共同孵育24小时。

1.6 MTT法测细胞活力 取对数生长期PC12细胞，消化、离心后用完全培养液重悬，浓度为1×104μmol/mL，接种于96孔板，每孔加细胞培养液100μL，细胞贴壁后，吸取旧的培养液，每组设4个平行样本，按上述分组处理后，各孔吸去上清液20μL，加浓度为 0.5mg/mLMTT 20μL，继续培养4小时，然后每孔加200μL二甲基亚枫，震荡8分钟，使紫色结晶充分溶解，空白孔调零，酶联免疫检测仪上测每孔吸光度即OD值(检测波长570 nm)。

1.7 LDH测定 取对数生长期PC12细胞，经胰酶消化后，吹打成单细胞悬液，将细胞按照以1×105/孔的密度接种于96孔板，每孔加细胞培养液90μL，每组设8个平行样本，根据实验分组处理后，按LDH试剂盒说明进行标本的测定。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)。LDN活性 =(ODu-ODc)/(ODs-ODb)×Cs×N×1000式中：ODu为测定管吸光度值、ODc空白管吸光度值、ODs为标准管吸光度值、ODb为对照管吸光度值、Cs为标准浓度(2mmol/L)、N为样品测试前稀释倍数。

1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡 1)取对数生长期PC12细胞(1×105/孔)，接种于6孔板，实验分组如前处理；2)处理后经胰酶消化、吹打成单细胞悬液，移入离心管中；3)将离心管于1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS漂洗1次后，重复离心洗涤一次；4)依据试剂盒说明进行操作，将细胞重悬于500μL binding buf fer中，再分别加入5μL的AnnexinV-FITC溶液和10μLP1染液，避光于室温放置5分钟；5)转至流式检测管，上机检测，实验同法重复3次。

1.9 统计学方法 数据采用SPSS 13.0统计软件进行处理，计量资料采用(χ±s)表示，采用单因素方差分析(F检验)，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 培养细胞形态学观察 正常组PC12细胞生长速度快，贴壁良好，大多伸出长的轴突，容易成簇生长。在模型组中细胞明显损伤，数量显著减少，可见PC12细胞肿胀、圆缩，突起回缩，贴壁功能下降，有脱壁漂浮现象。

2.2 MTT检测结果 MTT法测定各实验组的OD值显示，模型组所测的OD值为(0.64±0.40)，空白血清组(0.78±0.14)，2组没有差异；空白组的OD值为 (1.35±0.27)，与模型组比较有显著性差(P＜0.01)，显示造模成功；当归小、中、大3个剂量组OD值均比模型升高，其中高剂量组与小剂量组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，结果见表1。

表1 当归大鼠含药血清对Aβ25-35损伤PC12细胞的OD值和LDH活性的影响(χ±s)

2.3 LDH检测结果 测定各实验组LDH的OD值显示，模型组所测的OD值为(875.5±102.27)，空白血清组(832.72±186.5)，2组没有差异；空白组的OD值为(438.47±99.84)，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)，显示造模成功；当归小、中、大3个剂量组OD值均比模型升高，其中高剂量组与小剂量组比较有明显差异，有统计学意义(P＜0.05)，中剂量组与小剂量组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，结果见表1。

2.4 细胞凋亡检测结果 与模型组比较，空白组有显著性差异，有统计学意义(P＜0.05)，显示造模成功；当归小、中、大3个剂量组细胞活力均比模型升高，各当归组与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。与当归小剂量组与大剂量组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2和附图1-6。

表2 当归大鼠含药血清对Aβ25-35损伤PC12细胞活力和凋亡率的影响(χ±s)

图1 -6 当归大鼠含药血清对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的影响

3 讨论

当归性味甘、辛、苦而温，入肝、心、脾经。《本草》云：“当归，治一切气，补一切血，破恶血，养心血。”《景岳全书·本草正》载：“当归，其味甘而重，故专能补血；其气轻而辛，故又能行血。补中有动，行中有补，诚血中之气药，亦血中之圣药也。”可见当归既可益阴血而补肝体，养血安神，又可舒肝气而助肝用，调气机而畅情志，气血同调，心肝并治，对老年性痴呆精神与行为失常的防治具有很好的理论针对性。

本实验结果表明，在Aβ25-35诱导的作用下，PC12细胞发生显著的凋亡，当归各含药血清能升高PC12细胞的活力，降低 LDH释放，对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡有明显的保护作用。有报道，采用大剂量当归治疗脑中风后遗症，其不仅能改善后遗症，且能明显改善中风患者出现的记忆力减退等认知功能障碍，并未见明显副作用［1］。现代药理研究表明，当归可清除体内氧自由基，抗脂质过氧化物反应，具有明显的抗衰老功能［2-11］；当归能降低血管性认知障碍大鼠脑组织中AChE含量，升高其血中SS含量，体现出对中枢胆碱能神经递质活性和数量的调节作用［12］；当归提取物可剂量依赖性地减弱Aβ1-42诱导的神经毒性和tau蛋白磷酸化，同时，它能增加Akt的丝氨酸磷酸化水平，并下调GSK-3β活性，说明当归提取物保护神经细胞的作用与PI3K/Akt/GSK-3β信号通路有关［13］；当归根的乙醇提取物对Aβ诱导的神经毒性有保护作用，并能升高线粒体跨膜电位Del taPsim［14］。关于当归抗凋亡的保护作用，仍有待进一步深入研究。

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