MTT法测定补骨脂素和鱼腥草素钠在体外对阴道毛滴虫的杀灭作用*

孙宝清 ，蔡纳新 ，许子华 ，谭桂莲 ，董会霞 ，魏秋芬

1首都医科大学燕京医学院，北京 101300；2首都医科大学基础医学院

阴道毛滴虫是一种寄生在人体阴道及泌尿道的寄生虫，可引起滴虫性阴道炎、滴虫性尿道炎等。滴虫性阴道炎是一种呈世界性分布的性传播疾病，孕期妇女感染滴虫可导致早产、死胎及低体质量儿出生，另外滴虫病与不孕症及子宫癌的发生也密切相关［1-2］，并可增加HIV感染机会。目前，临床上治疗滴虫性阴道炎主要采用甲硝唑或替硝唑等咪唑类药物。然而随着应用范围的扩大与应用时间的延长，不断有新耐药株产生，并且研究发现甲硝唑具有致畸、致癌、恶心、胃肠不适等副作用［3］。多种中药提取物如大黄酸等［4］、双氢青蒿素包含物［5］对阴道毛滴虫在体外均有杀灭作用。从传统中药中选择安全、有效、低毒的抗阴道毛滴虫新药是一个行之有效的途径。为此，我们采用MTT法测定补骨脂素和鱼腥草素钠在体外对阴道毛滴虫的杀灭作用。

1 材料与方法

1.1 试剂 补骨脂素 (Psoralen)，批号：110739-200814；鱼腥草素钠 (Sodium Hout tuyfonate)，批号：100247-199601；甲硝唑，批号：100191-200305，以上试剂均购自中国药品生物制品检定所。噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)，购自北京市欣经科生物技术有限公司，进口分装。

1.2 虫株 阴道毛滴虫虫株取自北京市顺义区医院门诊已确诊为滴虫性阴道炎患者阴道后穹窿分泌物，实验室分离培养的阴道毛滴虫，接种于无菌肝浸汤培养基中，同时加入青霉素和链霉素抗菌，置37℃培养箱中培养48～72小时后转种传代，稳定培养3代后用于实验。

1.3 仪器 TCQ-250超声清洗仪(苏州比能信电气有限公司)，WD-2102A型酶标仪(北京市六一仪器厂)，血球计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司)，CX31型生物显微镜(日本奥林巴斯株式会社)，48孔细胞培养板 (Becton Dickinson Labware，公司)，96孔酶标板(上海荣泰生化工程有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 肝浸汤培养基制备 取新鲜兔肝30 g，切碎成米粒大小，加入蒸馏水200mL混匀，放置于4℃冰箱中24小时，取出后煮沸30分钟，用8层纱布过滤后定容，失去的水分用蒸馏水补足。加入蛋白胨5 g、葡萄糖1.25 g，充分混匀后加热促溶，经滤纸过滤，调节pH值5.6～6.0，分装试管，每管分装4mL，高压蒸汽灭菌(113℃、20分钟)，冷却后放置37℃恒温培养箱中24小时，证明无菌后储存于-20℃冰箱，备用。接种前取出培养基放置室温融化，用前每管加1mL灭能无菌小牛血清和青霉素、链霉素。

1.4.2 虫株的培养 取稳定培养3代后的阴道毛滴虫，2 000 r/min离心5分钟后弃上清，用新鲜灭菌肝浸汤培养基洗涤2～3次弃上清，再加入含20%灭能无菌小牛血清的肝浸汤培养基混匀，用血球计数板计数虫体密度，调整虫体密度为3×105个/mL浓度，活虫率大于90%的可用。

1.4.3 试剂配制 3种试剂均用含血清和双抗的培养基配置。先配置成一定浓度，在用连续倍比稀释法稀释成所用浓度。甲硝唑的5个浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625(单位为 mg/mL)。补骨脂素的五个浓度为 8、4、2、1、0.5(单位为 mg/mL)。鱼腥草素纳的 5个浓度 1、0.5、0.25、0.125、0.0625(单位为mg/mL)。超声助溶，备用。

1.4.4 加样 实验组：于48孔细胞培养板上分别加入以上试剂的不同浓度各0.6mL。对照组：加入培养基0.6mL/孔。以上各孔设3个平行孔。每孔均加入虫液0.6mL/孔，轻轻摇匀。不加虫液和药物的无菌培养基1.2mL为空白对照。将培养板置37℃恒温培养箱中培养。

1.4.5 检测 MTT法测各管吸光度(A)值。在培养 2、4、8、16、24小时后将细胞培养板从培养箱中取出，将各孔混匀后分别吸出200μL，加入EP管中，加MTT 20μL/EP管，37℃继续培养4小时后，2 000 r/min离心5分钟，弃上清液，用无菌生理盐水洗涤2～3次，2 000 r/min离心5分钟，弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)0.2mL/EP管，室温放置5分钟，将EP管中的液体移入96孔酶标板，用酶标仪测定吸光度。以空白孔调零，主波长为492 nm，测定各孔吸光度A值。本实验重复3次，3次实验结果反应的规律基本一致。

1.5 计算 根据下列公式计算出阴道毛滴虫死亡率，见表1。

注：A对照孔对照孔吸光度均值；A实验孔实验孔吸光度均值

表1 各种药物不同浓度不同作用时间阴道毛滴虫死亡率

2 结果

2.1 补骨脂素和鱼腥草素钠体外杀灭阴道毛滴虫的效果 补骨脂素和鱼腥草素钠在相同药物浓度下，随着药物作用时间的延长，滴虫死亡率逐渐升高(P＜0.05)；补骨脂素、鱼腥草素钠在不同浓度下，阴道毛滴虫死亡率不同(P＜0.05)；不同作用时间阴道毛滴虫死亡率不同(P＜0.05)。

2.2 甲硝唑与鱼腥草素钠杀灭阴道毛滴虫效果比较 在药物浓度分别为 1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL时，对甲硝唑与鱼腥草素钠的作用结果进行比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

中药补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea coryl i-foliaL.的干燥成熟果实，始载于《雷公炮炙论》具有补肾助阳、纳气、止泻的功效［6］。补骨脂具有抗肿瘤作用、雌激素样作用和对骨质的作用、光敏性、抗氧化作用、抗菌作用、保肝作用、抗抑郁等作用［7］。补骨脂中的化学成分主要有香豆类、黄酮和萜酚类化合物。补骨脂素(Psoralen)属于香豆类的化学成分。本实验研究发现补骨脂素具有抗阴道毛滴虫作用，这与文献补骨脂药理作用与临床应用研究进展［8］报道一致。鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜的新鲜全草或干燥地上部分，广泛分布于我国南方各省区，为重要传统的食药两用植物。鱼腥草味辛，性微寒，归肺经，始载于《名医别录》［9］现代药理学研究表明，鱼腥草具有抗病毒、抗菌、抗炎镇痛、止咳及增强特异性和非特异性免疫的功能［10］。鱼腥草素钠(Sodium Hout tuyfonate)属鱼腥草提取物。本实验研究发现鱼腥草素钠具有抗阴道毛滴虫作用。实验研究结果将为高效低毒抗阴道毛滴虫新药物的研发提供依据。

［1］ Chen WL，Chen JF，Zhong XR，et al.Ult rast ructural and immunohistochemical studies on trichomonas vaginalis adhering to and phagocytizing genitourinary epithel ial cel ls［J］.Chin Med J，2004，177(3)：37-41.

［2］ 祝宗峰，于成山，张有申，等.960例妇科门诊患者阴道毛滴虫感染情况分析［J］.中国病原生物学杂志，2006，1(3)：211-215.

［3］ 李晓峰，李倩，张畔，等.探讨荆芥体外抗阴道毛滴虫的效果［J］.中国微生态学杂志，2009，21(4)：340-342.

［4］ 孙宝清，张丽娟，谭桂莲，等.大黄酸、大黄素和打黄酚体外抗阴道毛滴虫作用的观察［J］.现代预防医学，2013，40(19)：3654-3656.

［5］ 张丽娟，吴常委，钟家亮，等.双氢青蒿素包含物的制备及对阴道毛滴虫的杀灭作用观察［J］.中国药师，2011，14(5)：625-627.

［6］ 柴丽娟，张晗，王少峡，等.中药补骨脂的药理作用研究进展［J］.海峡药学，2013，25(7)：12-13.

［7］ 辛丹，颜冬梅，王跃飞，等.补骨脂及其相关化学成分的药理与毒理研究进展［J］.辽宁中医药大学学报，2009，11(7)：70-72.

［8］ 曹金一，刘京晶，黄文华，等.补骨脂药理作用与临床应用研究进展［J］.中药药理与临床，2008，24(6)：89-91.

［9］ 国家药典委员会.中国药典［M］.北京：化学工业出版社，2005：155.

［10］程训民，沈继录，徐元宏，等.鱼腥草素钠(粉针剂)体外抗菌活性的初步研究［J］.时珍国医国药，2005，16(5)：465-466.