MALDI-TOF MS测定多肽类聚合物相对分子质量的条件优化

余惠娟褚曰环邵光江帆巢晖

(1中山大学化学与化学工程学院 广东广州510275;2深圳市出入境检验检疫局工业品检测技术中心 广东深圳518017)

随着经济水平的不断发展，实验条件在逐步改善，仪器资源也在不断增加，大型仪器也逐渐服务于基础实验教学，在培养学生独立思考能力和掌握科研技能方面起到了很好的促进作用。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDITOF MS)是一种新型的软电离质谱，可以使不易气化、电离的样品分子实现离子化，且具有灵敏度高、分辨率高、准确度高、分析速度快以及相对分子质量检测范围大等优点［1-2］，近年来已成为聚合物性能分析的一个不可缺少的手段。MALDI-TOF MS在应用于测试高分子聚合物相对分子质量的过程中，必须选择适合该聚合物样品的溶剂、基质和阳离子化试剂。本文将从这些方面来探索聚苄氧羰基赖氨酸样品测试条件的优化，从中可以培养学生发现问题、分析问题和解决问题的能力。

基质的选择是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测试的核心，它是测试成功与否的关键因素［3］;其次，样品溶剂的选择也具有非常大的影响。在MALDI-TOF MS检测中，多肽类高分子聚合物属于聚合物的范畴，然而对多肽类聚合物的测试目前还没有很成熟的方法，简单地利用常规的聚合物基质如2，5-二羟基苯甲酸(2，5-DHB)、α-腈基-4-羟基肉桂酸(CHCA)反-2-［3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-亚丙烯基］丙二腈(DCTB)等来对其进行检测，往往不能得到有效的谱图，所以找到一种良好的测试方法就显得十分必要。本文拟通过改变聚苄氧羰基赖氨酸(图1)样品溶剂、基质及添加阳离子试剂等条件，来探索多肽类聚合物测试条件的优化，从而得到最佳的测试结果。

图1 聚苄氧羰基赖氨酸的结构式

1 实验材料和试剂

样品:聚苄氧羰基赖氨酸，测试用户提供，重复单体M=262。

基质:DCTB、CHCA、2，5-DHB、蒽三酚(Dithranol，DIT)，购于德国Bruker Daltonics公司。

溶剂:六氟异丙醇、氯仿、二氯甲烷、三氟乙酸、三氟乙酸钾，购于阿拉丁，分析纯。

2 仪器及实验条件

仪器:基质辅助激光解吸电离高分辨飞行时间质谱仪，MALDI-TOF MS ultrafleXtreme，德国Bruker Daltonics公司，氮激光器，波长355 nm，不锈钢样品靶。

实验条件:样品与基质采用相同溶剂，配置成10 g/L，按体积比1∶1混合后，取2μL点在样品靶上，自然干燥后测试，采用反射模式，正离子检测。激光频率为1000 Hz，离子延迟提取时间为120 ns，能量范围30%～50%，使用标准多肽进行校正。

3 结果和讨论

3.1 基质不变、改变溶剂

图2中展示的质谱图基质均为DCTB，溶剂分别为氯仿、二氯甲烷、二氯甲烷(85%)和三氟乙酸(15%)的混合溶剂、氯仿(85%)和三氟乙酸(15%)的混合溶剂以及六氟异丙醇。实验结果表明，溶剂的选择对质谱检测结果有一定的影响，用六氟异丙醇作为溶剂比用其他溶剂的效果更好，但是这些质谱图的信号强度都不高，背景干扰较大。

3.2 溶剂不变、改变基质

基质的作用是与样品形成共晶体、吸收激光能量和解离样品。从3.1中可知采用六氟异丙醇作为溶剂效果较好。为进一步优化测试，本实验继续采用六氟异丙醇作为溶剂，尝试更换不同基质进行试验。图3(a)采用2，5-DHB作为基质，图3(b)采用CHCA作为基质，图3(c)采用DIT作为基质，试验结果显示，采用2，5-DHB、CHCA、DIT作为基质的信号强度明显比采用DCTB作为基质的高很多，且采用DIT作为基质的测试效果最好，背景干扰的影响较小，测出样品的相对分子质量范围和信噪比最大。

图2 基质均为DCTB的质谱图

3.3 选中基质、再次改变溶剂

由于基质的选择是MALDI测试成功与否的关键因素之一，所以在筛选出一个较好的基质之后，尝试改变溶剂，进一步探索溶剂对测试效果的影响。如图4所示，DIT作为基质时，各种溶剂均能得到样品的相对分子质量信息，但仍然是以六氟异丙醇作为溶剂的效果最好。

图3 溶剂均为六氟异丙醇的质谱图

3.4 添加阳离子助剂

在MALDI-TOF MS的分析过程中，蛋白质样品可以在基质的作用下通过质子化作用被电离。而聚合物样品则不易电离，通常需要加入某种单价阳离子，如Na+、K+和Ag+，配合基质的作用来实现样品离子化。本实验尝试加入三氟乙酸钾作为阳离子助剂进行实验，基质、样品、阳离子助剂的比例为5:1:5，结果如图5所示。在加入三氟乙酸钾作为阳离子助剂后，发现整个谱图没有了背景干扰，信号强度明显增强，测出样品的相对分子质量范围更大。

4 结论

(1)用六氟异丙醇作为溶剂比氯仿、二氯甲烷、二氯甲烷(85%)和三氟乙酸(15%)的混合溶剂、氯仿(85%)和三氟乙酸(15%)的混合溶剂的效果更好，因为其极性强，能够充分溶解聚多肽和基质，使样品和基质能够很好地结晶，其沸点也低，容易挥发。而其他溶剂要么对样品的溶解性差，要么沸点高、挥发性差。

(2)蒽三酚可以有效地和聚多肽结合，在激光照射到样品靶的时候可以有效地吸收能量，并将能量传递给聚多肽，使其电离。

图4 基质均为DIT的质谱图

图5 采用DIT作为基质、六氟异丙醇作为溶剂、三氟乙酸钾作为阳离子助剂的质谱图

(3)选择合适的阳离子化试剂，可有效帮助样品离子化。然而阳离子化试剂既要考虑其离子化作用，又不能干扰基质与样品形成共结晶。

用MALDI-TOF MS来检测多肽类聚合物相对分子质量时，选择蒽三酚作为基质，六氟异丙醇作为溶剂，并加入适量的三氟乙酸钾作为阳离子助剂，可以得到较好的检测结果。本实验的实施过程是一个实验条件逐步优化的过程，从中可以培养学生发现问题、分析问题和解决问题的能力。本实验不仅可设计为高年级本科生和研究生实验技能的培训课程，同时其研究成果也可以使公共实验室的仪器更好地为师生的科研服务。

［1］倪国新，朱镭，马小土，等.分析化学，2009，37(9):1291

［2］汪正范，刘娜，张婷.现代仪器，2009，15(6):77

［3］向弘，朱斌，徐昕荣，等.广东化工，2009，8(36):85