早发型重度子痫前期分娩前后CD28/CTLA-4的相关研究

张娜娜，吕英璞，杨石芳，陈艳珺，张文真，李从伟

妊娠期高血压疾病是产科常见疾患，发病率约为5%～8%，造成的孕产妇死亡约占妊娠相关死亡总数的10%～16%[1]，子痫前期是其中最常见的一种类型，常并发心、脑、肝、肾等全身脏器的损害，是导致孕产妇及围生儿病死率升高的主要原因。至今其发病原因尚未完全阐明，本研究用流式细胞技术测定早发型子痫前期患者分娩前后协同刺激分子白细胞分化抗原28（CD28）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 （cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4）、CD28/CTLA-4表达水平的变化，进一步探讨子痫前期发病的病因。

1 对象与方法

1.1 对象来源 选取2011年2月—2014年2月在石家庄市第三医院和石家庄市第一医院产科诊治的早发型重度子痫前期患者30例：平均（29.63±4.06）岁，平均妊娠时间（229.40±5.82）d，平均动脉压（131.89±8.67）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），新生儿体质量（2311.67±349.55）g。患者均为初产妇，单胎，均无近期感染证据，血糖正常，无慢性高血压病史，无反复流产史，未经辅助生殖技术治疗，无免疫性疾病，未经免疫药物治疗。早发型重度子痫前期的诊断标准按照苟文丽主编《妇产科学》第8版。分娩前：指入院时、治疗前；分娩后：分娩后48 h内。

1.2 方法

1.2.1 实验试剂 抗人PE-CY5-CD3单克隆抗体、抗人PECY5-CD4单克隆抗体、抗人PE-CY5-CD8单克隆抗体、抗人异硫氰酸荧光素（FITC）-CD28单克隆抗体、抗人PE-CTLA-4单克隆抗体、抗鼠PE-IgG、抗鼠FITC-Ig均购自美国Becton-Dickinson公司。

1.2.2 血标本采集 抽取妊娠28～34周子痫前期患者治疗前及分娩后48 h内的肘正中静脉血，分离淋巴细胞[2]，①取肝素抗凝血以磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，离心；②放置于淋巴细胞分离液上，使细胞悬液与分离液体积比为2∶1，离心30 min；③用吸管吸出单个核细胞，PBS冲洗；④将悬浮附壁的单个核细胞吹打成细胞悬液，Hank′s液冲洗。

1.2.3 流式细胞法检测 调整分离得到的淋巴细胞浓度为1×106/mL，加入抗人单抗 PE-CY-CD3，PE-CY-CD4，PE-CYCD8，加入抗人单抗CD28-FITC，抗人单抗CTLA-4-PE及小鼠IgG同型阴性对照 12 h内送流式检验 CD3、CD4、CD8、CD28和CTLA-4的比率。

1.2.4 肝、肾功能检测 抽取患者空腹肘正中静脉血2 mL送生化实验室完成。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。检验结果正态分布以均数±标准差（x±s）表示，进行配对t检验，非正态分布数据以中位数（百分位数）[M（P25，P75）]表示，进行Wilcoxon秩和检验，相关性检验采取Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分娩前后患者血压及肝肾功能比较 分娩后患者血压、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、血肌酐、尿素氮和尿酸均显著下降，与分娩前比较差异有统计学意义（均P＜0.01），24 h尿蛋白比较差异无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 分娩前后患者血压及肝、肾功能各指标水平（n=30±s）

表1 分娩前后患者血压及肝、肾功能各指标水平（n=30±s）

注：* 用 M（P25，P75）表示。

AST（U/L）分娩前 165.67±10.72115.17±9.42131.89±8.6733.10±7.6132.60±9.28分娩后 144.33±7.64 98.53±8.72113.80±7.6727.50±8.0728.27±8.17 t或W 10.101 9.044 10.331 6.414 4.640 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000组别 收缩压（mmHg）舒张压（mmHg）平均动脉压（mmHg）ALT（U/L）24 h尿蛋白*（g）分娩前 107.77±27.14 6.67±1.64 382.57±39.864.34（3.36，6.80）分娩后 95.93±21.80 5.83±1.55 331.77±47.883.92（2.93，5.12）t或W 5.702 6.478 7.842 810.500 P 0.000 0.000 0.000 0.122组别 肌酐（μmol/L）尿素氮（mmol/L）尿酸（μmol/L）

2.2 分娩前后患者T细胞亚群比较 早发型重度子痫前期患者分娩前CD3+、CD8+比率低于分娩后，CD4+比率高于分娩后，差异有统计学意义（均P＜0.01），见表 2。

表2 分娩前后患者T细胞亚群的水平 （n=30，%±s）

表2 分娩前后患者T细胞亚群的水平 （n=30，%±s）

检测时间 CD3+ CD4+ CD8+分娩前 66.56±8.13 46.85±3.23 23.94±5.61分娩后 71.38±7.67 44.02±5.80 27.26±4.69 t－4.450 2.981 －2.676 P 0.000 0.006 0.001

2.3 分娩前后患者CD28+、CTLA-4+细胞百分比及CD28+/CTLA-4+情况比较 早发型重度子痫前期分娩前 CD3+CD4+CTLA-4+、CD3+CD8+CTLA-4+高于分娩后，CD3+CD4+CD28+/CD3+CD4+CTLA-4+、CD3+CD8+CD28+/CD3+CD8+CTLA-4+低于分娩后，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表3。CD3+CD4+CD28+/CD3+CD4+CTLA-4+、CD3+CD8+CD28+/CD3+CD8+CTLA-4+两者无直线相关性（r=－0.037，P=0.844）。

表3 分娩前后患者CD28、CTLA-4细胞百分比及CD28/CTLA-4 情况比较 （n=30，%±s）

表3 分娩前后患者CD28、CTLA-4细胞百分比及CD28/CTLA-4 情况比较 （n=30，%±s）

注：* 用 M（P25，P75）表示。

CD3+CD4+CD28+CD3+CD8+CD28+CD3+CD4+CTLA-4+*分娩前 46.64±6.74 10.95±2.09 0.45（0.33，0.78）分娩后 49.38±9.90 11.72±2.47 0.30（0.20，0.51）t或Z －1.347 －1.627 749.500 P 0.188 0.115 0.014检测时间检测时间CD3+CD8+CD28+/CTLA-4+分娩前 2.60±0.64 109.21（57.19，167.08） 4.52±1.67分娩后 2.16±0.85 163.74（97.53，209.48） 6.07±1.94 t或 Z 2.447 -775.000 －3.063 P 0.021 0.038 0.005 CD3+CD8+CTLA-4+CD3+CD4+CD28+/CTLA-4+*

3 讨论

3.1 CD28、CTLA-4对T细胞的免疫调节作用 正常生理妊娠类似于同种异体移植，作为同种移植物的胚胎在母体内存活直至分娩，实际上反映母体对胚胎抗原的免疫耐受，这种免疫调节作用不仅发生在母-胎界面局部，而且也发生于母体外周。在母-胎免疫微环境中，有多种细胞和细胞因子参与这种免疫调节作用[1-3]。

CTLA-4、CD28都是免疫球蛋白超家族糖蛋白，结构上约有31%同源，特别在胞内区[4]，具有相同的配体B7，B7主要表达于B细胞表面，是一种重要的B细胞激活抗原。B7抗原主要包括3类分子：B7-1、B7-2及 B7-3[5]。B7-1、B7-2存在于活化的T 细胞、B细胞、树突细胞及γ干扰素（IFN-γ）活化的单核细胞中。另外，B7-2的表达早于B7-1，在T细胞激活初期，由B7-2提供T细胞活化所需要的共刺激信号，B7-1在T细胞克隆增殖中起作用[6]。CTLA-4、CD28都能与B7-1、B7-2结合，但CD28与之结合的亲合力较CTLA-4低20倍。而且CD28与B7结合提供协同刺激信号，以激活T细胞；而CTLA-4与B7结合抑制T细胞活化，使T细胞无能。如果辅助性T细胞（Th细胞）识别低表达B7分子的抗原提呈细胞（APC），CTLA-4则以更高亲合力结合B7，从而导致T细胞不能正常活化[7]，进一步阻断协同刺激信号，有助于实现母-胎免疫耐受。

3.2 CTLA-4、CD28在子痫前期中的表达 目前关于子痫前期的病因学研究较多，关于CD28，CTLA-4的研究论著较少，且研究结果不一。Samsami Dehaghani等[8]报道，胎盘中CTLA-4 A49G等位基因中的杂合型可能是重度子痫前期发生的易感基因。Buurma等[9]报道22个复制的基因变异中，与子痫前期有关的遗传变异有7个：血管紧张素转换酶（ACE），CTLA-4，凝血因子2（F2），凝血因子Ⅴ（FⅤ）两个变种RS6025和RS6020，脂蛋白脂酶（LPL）和纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂Ⅰ型（SERPINE1）。这些变异体也是心血管疾病的风险因素，显示子痫前期和心血管疾病有共同的遗传风险因子。Pendeloski等[10]研究巴西女性 CTLA4（+49 A/G）（rs 231775），CD28（+17T/C）（rs3116496）和诱导共刺激分子（ICOS）（－1564 T/C）（rs 4675378）基因多态性与子痫前期的关系，发现子痫前期组ICOS（－1564）T等位基因型频率和基因频率显著低于正常妊娠组，而CTLA-4（+49 A/G）和 CD28（+17 T/C）2组差异无统计学意义。表明子痫前期与ICOS基因多态性相关联，而非CTLA-4或CD28基因多态性。Toldi等[11]比较20例子痫前期孕妇和20例正常孕妇，发现吲哚胺2，3双加氧酶和共刺激分子B7-1，B7-2在子痫前期孕妇中的表达低于正常妊娠孕妇，而CD3+CD28+，CD3+CD28+CTLA-4+，CD4+CD28+，CD4+CD28+CTLA-4+2 组差异无统计学意义

复发性流产（RSA）免疫机制方面也表现为母胎免疫耐受，与子痫前期有相似之处。有学者研究正常妊娠组蜕膜组织CTLA-4的表达高于RSA组，而在外周血中的表达差异无统计学意义，认为蜕膜组织淋巴细胞CTLA-4的表达情况在母胎界面免疫耐受调控中起重要作用[12]。

本研究发现早发型重度子痫前期分娩前CD3+、CD8+均低于分娩后，CD4+高于分娩后，分娩前CD3+CD4+CTLA-4+，CD3+CD8+CTLA-4+高于分娩后，CD3+CD4+CD28+/CD3+CD4+CTLA-4+、CD3+CD8+CD28+/CD3+CD8+CTLA-4+低于分娩后，可能说明CTLA-4与重度子痫前期发生有关，高表达的CTLA-4促进CD4+T淋巴细胞高度活化，抑制CD8+T淋巴细胞，致T淋巴细胞失衡，子痫前期患者妊娠耐受失衡，发生不良妊娠结局。这与王莲莲等[13]的研究结果有相似之处。

分娩前后CD3+CD4+CD28+/CD3+CD4+CTLA-4+与CD3+CD8+CD28+/CD3+CD8+CTLA-4+两者之间无直线相关性，更加支持子痫前期患者体内CD4+/CD8+和CD28/CTLA-4+的免疫偏移是同时存在的，这种免疫耐受的失衡可能是子痫前期发生的原因之一。目前，关于CD28/CTLA-4与子痫前期关系的报道甚少，结论不一，仍需大量实验来验证。

总之，本研究发现早发型子痫前期患者分娩后CTLA-4下降，CD28/CTLA-4升高，可能CTLA-4与CD28/CTLA-4的异常表达与子痫前期的发病有关。因子痫前期发病的异质性、细胞因子的网络性，子痫前期发病的实质性研究尚需大量大样本、多层次、多角度的进一步研究。

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