献血者抗-HCV检测及确认结果研究进展

张秀慧 钟政荣 余加宏

丙型肝炎病毒(HCV)全球感染率约2.35%，慢性感染人口约有 1.6亿［1］。我国 HCV的感染率为3.2%［2］。HCV的传播途径主要是因输血或血液制品，有关调查研究显示随着输血量的增大，输血后丙型肝炎感染的危险性随之增大［3］。因此，如何更好的提高HCV检出的灵敏度、减少漏检、保障血液安全一直是人们注意的焦点。但在低感染率人群中，间接酶联免疫(ELISA)法检测丙肝抗体(抗HCV)存在较高的假阳性率。血站目前多数采用两遍ELISA法对血液进行抗-HCV的检测，其反应性样本确证阳性率较低，约30%左右;单试剂反应性样本和灰区反应性样本的阳性率则更低，这使得很多献血者被误淘汰，因此，近几年越来越多的输血领域学者在关注献血者归队问题［4，5］。故为了避免假阳性结果对献血者心理造成不良影响及减少献血人员的流失，对初筛结果做进一步确认的重要性也日益突出。同时，阴性样本经核酸检测的确证试验发现也存在一定的漏检率。本文将对丙肝抗体的确认情况研究进展综述如下。

1 HCV的生物学性状及临床意义

HCV病毒体呈球形，直径＜80 nm(肝细胞中为36～40 nm，在血液中为36～62 nm)，外有脂质外壳、囊膜和棘突结构，内有由核心蛋白和核酸组成的核衣壳。HCV为单股正链RNA病毒，由9 500～10 000 bp组成，基因组序列具有高度变异性，分为6个基因型和80多种基因亚型。其RNA由编码区(9 030 bp)、5-非编码区(332 bp)和3-非编码区(54 bp)组成。编码区包括结构区和非结构区(NS)基因。结构基因分C区和E区，相应的编码产物是核心蛋白和包膜蛋白，由它们组装病毒颗粒。非结构基因分为NS1、NS2、NS3、NS4、NS5 基因，相应的编码产物是 NS1、NS2、NS3、NS4、NS5 蛋白［6］。

HCV主要经血液或血液制品传播，感染人体后引起丙型肝炎，其中输血后肝炎(PTH)中有90%为丙型肝炎［7］。由于丙肝病毒是RNA病毒，极易变异，目前尚未研制出有效预防丙型肝炎的疫苗。而且丙型肝炎在临床上易转化为慢性丙型肝炎、肝硬化，最后发展为肝癌，严重危害患者健康和生命。

2 HCV的传统检测方法

人体感染HCV后产生抗HCV，1990年开始被美国FDA批准作为感染HCV的标志。目前，国内外对献血者丙肝病毒的筛查主要采用间接ELISA法检测抗HCV。ELISA法是应用最为广泛的酶免疫测定技术。其基本原理是将抗原(抗体)在不破坏其免疫活性的条件下预先结合到固相载体表面，再将待测抗体(抗原)和酶标抗原(抗体)按一定顺序与结合在固相载体上的抗原(抗体)反应并形成免疫复合物，经洗涤去除反应体系中的其他物质，使固相载体上的免疫复合物与待测抗体(抗原)的量呈一定比例，加入酶反应底物后，底物即被固相载体上的酶催化变为有色产物，最后根据颜色深浅进行定量或定性分析。ELISA是一种定性试验，其判断有无反应性的标准是根据被检测样本与试剂反应终止后的吸光度值是否大于阈值来决定。它具有价格低廉、反应时间短、操作简单、对环境及设备要求不高等优点，被广泛应用于采供血系统以及临床检测。

采供血系统采用的间接ELISA试剂盒已经发展到第3 代，所用抗原包括了 C、NS3、NS4、NS5，较第 1、2 代大大提高了抗HCV检出率。但由于:①抗HCV的“窗口期”特别长，即人体从感染HCV到产生抗HCV需要的时间，45 ～68 d［8］;②目前，抗HCV ELISA 试剂盒均采用基因工程或合成多肽抗原包被固相，以间接法测定，由于HCV为RNA病毒，抗原易产生变异，其特异性方面存在不足;③不同的ELISA试剂生产厂家包被抗原的来源和组成上存在差异;④工作人员操作不当等。采供血系统工作人员在筛查无偿献血者这种低危人群的血液标本时，常出现灰区或单试剂呈反应性的标本，难以判读结果。

宋美兰等［9］对常规国产和进口双试剂ELISA筛查抗HCV不合格的184份标本采用核酸和血清学重组免疫印迹试验(RIBA)加以确认，在抗HCV筛查不合格标本中，抗HCV ELISA双试剂阳性、单试剂阳性、灰区标本的假阳性率分别为23.9%、95.2%、96.1%，总假阳性率为67.9%。许晓绚等［10］对51例采用3种进口抗HCV ELISA试剂同时筛查抗HCV结果不一致的弱阳性标本，用重组免疫印迹试验和核酸检测进行确证，单一ELISA试剂假阴性率19.24% ～72.41%，试剂两两组合后假阴性率4.76% ～30.95%。因此，血站系统采用两个不同生产厂家的ELISA试剂仅可以一定程度的降低血液筛查中的假阴性率或假阳性率，但仍存在较高的比例，尤其是在弱反应性的灰区标本中。

目前，有试剂厂家研制出双抗原夹心法检测抗HCV的试剂盒，又被称为抗HCV“第4代”诊断试剂盒。其检测原理是用多表位HCV嵌合抗原(RHCVNS4-C-NS3-NS5)包被微孔酶联板，用修饰的HCV嵌合抗原标记长臂生物素(LC-Biotin-HCV-Ag)、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶(SA-HRP)及其他辅助试剂制成，应用双抗原夹心酶联免疫法原理检测血浆中的丙型肝炎病毒抗体。该检测方法在间接法检测IgG的基础上，增加了IgM的检测，大大缩短了窗口期，提高了抗HCV的检出率;同时通过使用生物素-亲和素级联放大系统，对试剂的特异性有了大幅度提升，实验表明夹心法与RIBA的符合率为78.8%，远高于国产或进口间接法与 RIBA 的符合率(60.5%，50.0%)［11］。有研究报道，双抗原夹心法检测抗HCV所产生的灰区和假阳性标本大幅度减少，已获得我国国家食品药品监督管理总局(CFDA)的批准［12］。

ELISA试剂造成的假阴性或假阳性问题，不但给血液安全带来极大威胁，而且导致了献血源的浪费及带给献血者极大的心理压力，不利于献血事业的可持续发展。国外对血液筛查不合格的样本常规进行确证试验，并对假阳性样本的相应献血者保留献血资格，再次体检合格后仍可参加无偿献血，即献血者归队政策［4］。近几年来，我国学者对献血者归队政策也极为关注，通过研究提出了适合我国的抗HCV假阳性献血者归队方案［13］:①对实验室筛查抗HCV不合格的血液作报废处理，暂时屏蔽相关献血者;②对抗HCV反应性献血者进行2次不同试剂ELISA检测和HCVRNA检测，如抗HCV双试剂反应性或HCV-RNA反应性，则献血者永久屏蔽;对抗-HCV ELISA单试剂反应性且S/CO＜3.8(以Ortho为例)，HCV-RNA阴性的献血者180天后进行随访检测，若包含原试剂在内的2种试剂均为无反应性，且HCV-RNA为阴性，则该献血者可解除屏蔽恢复献血权利。刘宇宁［5］等抽取2004年到2006年上海市奉贤区血站血液抗HCV不合格样本82份，经ELISA试剂复检及核酸检测确证，结果复检假阳性归队率为54.88%，确证假阳性归队率为10.98%。由此可以看出抗HCV筛查的假阳性归队率是很高的，为了更大程度的保留献血源，对抗HCV检测的初筛结果做进一步的补充确证试验是很有必要的。

3 HCV检测的确证试验

目前，国内外公认的HCV检测的补充确认试验有2个，即重组免疫印迹法(RIBA)和丙肝病毒核酸检测(NAT)。近几年，抗HCV分片段酶联免疫确认试验也被用作抗HCV的确证试验。

3.1 抗HCV重组免疫印迹法(RIBA) 免疫印迹试验的特点是利用聚丙烯酞胺凝胶电泳的分子筛和电泳的双重作用，将不同分子量蛋白和多肽由上而下分成不同条带，当这些条带转移到固相载体(例如硝酸纤维素膜)上，即可和相应抗体起免疫反应，再与酶标记的第2抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。RIBA也是一种定性试验，其区别于ELISA的是在固相载体上将不同抗原分成不同的条带而非混在一起包被到固相载体上，更具针对性，特异性高，可用于确证试验。RIBA的结果根据显色条带的多少及显色的深浅分为阴性、不确定性、阳性。重组免疫印迹试验是ELISA法筛查抗HCV可疑标本的确证试验，已发展到第3代，测试条带覆盖有 c22p、c33c、c100p、NS5 等4 个条带，分别代表了核心抗原和NS3、NS4、NS5抗原。

但由于RIBA试剂价格昂贵，试验技术要求高，操作复杂，在实际的血液筛查工作中难以推广。然而，一些学者认为ELISA法检测抗HCV的S/CO值大小与RIBA确证阳性有一定的相关性。有研究者对经ELISA试剂筛查抗HCV有反应性的标本用RIBA进行确证试验，结果表明，当S/CO值≥3.8这一阈值时，阳性预测值在95%以上，可以替代RIBA确证试验，降低试验成本［14］。但不同的生产厂家的抗HCV ELISA试剂有各自不同的阈值，并且同一试剂在不同地区的阈值也存在差异［15，16］。这可能是由于不同的ELISA试剂生产厂家包被抗原的来源和组成上存在差异以及不同地区丙型肝炎的流行毒株基因型不同所致。

此外，研究［17］还发现，对用两个不同生产厂家的抗HCV ELISA试剂检测的标本中，检测结果显示单试剂反应性的大多数标本经RIBA确认为阴性，但存在一定比例的不确定标本。Pereira等［18］对14例RIBA检测结果为不确定标本进行追踪调查，6个月后重新取样做RIBA确证试验，有20%标本确证为阴性，仍有80%标本存在不确定性。有研究者对RIBA不确定的标本进行了 NAT 检测，均未检测出 HCV-RNA［19，20］。Makuria等［21］认为标本RIBA不确定反应是由于既往感染HCV，恢复阶段抗体最终消失前残留丙肝病毒感染过的血清学证据。

再者，RIBA也是通过检测抗HCV的有无来确证HCV感染的，同样存在窗口期，仅能用于确证试验，不能用于HCV感染早期检测。

3.2 抗HCV分片段酶联免疫确认试验 抗-HCV分片段酶联免疫试剂是一种国产的抗HCV确证试剂，其基本试验原理与国外重组免疫印迹分析法相似，它将HCV抗原分为 C、NS3、NS4、NS5几个片段，分别包被在不同的酶标板上，用酶联免疫法对不同片段进行分别检测。

叶国强等［22］用国产的HCV分片段酶联免疫试剂检测经HCV RIBA 3.0确认的82份阳性标本中HCVC、NS3、NS4、NS5抗体并与之比较，总的检测率基本一致，有很高的符合率。也有研究［23］表明，HCV分片段酶联免疫确认试剂对单试剂反应性及灰区标本具有较好的确认性。HCV分片段酶联免疫试剂价格相对便宜，试验方法成熟，操作简单，易于推广。

3.3 丙肝病毒核酸检测(NAT) 早在1997年德国首先对HCV实施了核酸检测，随后美国、英国、瑞士等一些发达国家也对HCV实施并强制施行了HCV的核酸检测［24］。随着核酸检测技术自动化及试剂商品化的实现，多数国家都实施了丙肝病毒的核酸检测，我国也正在血液筛查中逐渐推广并普及该项技术［25］。

核酸检测技术是一系列能直接检测病原体核酸的技术总称，主要原理是使用一些物理学、化学和生物学技术和方法，通过其附带的信号扩增或靶核酸直接扩增方法，让肉眼看不见的极微量的核酸变成能直接观察的光电或可视信号，从而判断检测标本中是否存在相应的病原体。目前，血站系统采用的核酸检测方法主要有TMA 和 PCR两种。有研究［26，27］表明，这2种核酸检测方法在HCV-RNA检测的灵敏性、特异性和早期诊断方面，经统计学分析差异无统计学意义，都有较高的灵敏性和特异性，可以缩短窗口期，大大提高血液及输血的安全性。但不同厂家的核酸检测试剂检测结果有一定的差别。谷金莲等［28］对3种使用广泛的国产HCV-RNA定量检测试剂与进口罗氏HCV-RNA定量检测试剂进行比较，发现国产试剂的阳性检出率显著低于罗氏等进口试剂，且在HCV-RNA载量小于50 U/mL时，有较高的漏检率，而3种国产试剂之间阳性检出率无明显差异，因此，国产试剂的灵敏性还需进一步提高。

国内外学者对ELISA法双试剂进行献血者抗HCV的筛查，而后由NAT法确证，具体确证结果见表1。我们发现ELISA法双试剂检测抗HCV为阳性的样本中，确证阳性率为30% ～40%，最高有近70%为HCV-RNA检测阴性，表明ELISA法有较高的假阳性率，这可能由于健康人感染HCV后人体对丙肝病毒自限清除，或治疗后HCV暂时没有复制。黄成垠等［29］检测出1例ELISA法双试剂检测抗HCV阴性而NAT阳性的样本，并在68 d后复查抗HCV的结果为阳性，表明该样本的献血者处于HCV感染窗口期，存在病毒复制，但HCV抗体尚未形成。ELISA法双试剂检测抗HCV阴性的样本中NAT确证阳性率为十万分之一，特异性逼近100%，能够最大程度的保证血液的安全性。NAT直接检测病毒核酸的有无，是病毒存在的“金标准”，但刘峭梅等［30］发现约有0.71%的样本NAT检测为阴性而ELISA检测为阳性，表明仍不能忽视ELISA法在血液筛查的作用，ELISA法检测的是HCV抗体，NAT法检测的是HCV-RNA，采用这两种方法对同一标本的检测结果不是重复而是互补的。

表1 HCV采用双试剂ELISA法筛查NAT确证结果

4 确证试验在实际工作中的应用价值

目前，我国血站系统多采用2个不同生产厂家的ELISA试剂，对无偿献血者进行血液安全性筛查。但由于ELISA法“窗口期”较长，且不同生产厂家ELISA试剂盒酶标板包被的抗原比例不同、不同操作者之间操作误差较大等影响因素的存在，不可避免导致的误检率和漏检率。确证试验可降低在筛查低危人群抗HCV时所产生的假阳性及假阴性结果，提高阳性检出率及结果的准确性。对确证为假阳性的献血者实施归队政策，避免了血液资源的浪费，有利于无偿献血事业的可持续发展。确证试验对血液安全及用血安全都有一定的实用价值，能够最大程度的减低输血性丙型肝炎的传播。

综上所述，丙肝病毒ELISA法检测存在较高的误检和漏检率，其检测灵敏性仅有30% ～60%，对某些弱阳性样本的漏检率也在70%以上，尤其是单试剂和灰区的标本其检测特异性更低。这会造成大量的献血者被误判，且给献血者带来很大的思想负担，也会造成献血资源的浪费。有些厂家对第3代ELISA法抗HCV试剂进行改进，以提高其灵敏度和特异性，双抗体夹心法及抗原抗体联合检测应是发展的方向。为了提高血液及用血安全，也为了减少血液资源的浪费，丙肝病毒的确证试验是很有必要的。RIBA法是最早的确证试验，其缺点是试验结果中存在一部分不能确定的标本，一般建议跟踪随访或作进一步的NAT检测，而NAT的确认结果均为未检测到HCV-RNA。NAT法直接检测病毒核酸，是病毒存在的“金标准”，实验结果表明，经ELISA法抗HCV双试剂检测阴性样本经核酸检测仍有一定比例的阳性率(其阳性率约在十万分之一)，说明输血的安全风险依然存在。不同生产厂家的试剂其检测结果有一定的差别，血站实验室应综合考虑实验室的具体情况，选择特异性和灵敏度均较好的核酸检测试剂。但NAT不能取代ELISA，二者在检测原理及方法上均为互补，联合检测是目前安全合理的血液筛查手段。使用RIBA和NAT方法对ELISA抗HCV的检测结果进行进一步的复核与确认，可以为献血者的归队提供可能，也为献血者提供实验室诊断依据。但是因为RIBA法和NAT法的检测成本都较高，因此在保证血液安全的基础上如何更好地降低检测成本，将是我们努力的目标。

［1］ Lavanchy D.Evolving epidemiology of hepatitis C virus［J］.Clin Microbiol Infect，2011，17(2):107 －115.

［2］ 中华医学会肝病学分会中华医学会传染病与寄生虫病学分会.丙型肝炎防治指南［J］.中华肝脏病杂志，2004，12(4):194－198.

［3］ Kalantari H，Ebadi S，Yaran M，et al.Prevalence and risk factors of hepatitis B and C viruses among hemodialysis patients in Isfahan Iran［J］.Adv Biomed Res，2014，3:73.

［4］ Zou S，Musavi F，Notari EP，et al.Donor deferral and resulting donor loss at the American Red Cross Blood Services 2001 through 2006［J］.Transfusion，2008，48(12):2531 －2539.

［5］ 刘宇宁，蔡菊英，刘晓音.血液筛查HBsAg抗HCV假阳性献血者归队的调查分析［J］.中国输血杂志，2012，25(3):260－262.

［6］ 张立营，高博.丙肝病毒基因组结构及相关功能［J］.中国医药生物技术，2011，6(1):44－46.

［7］ 吴建军.不同人群无偿献血者HCV流行情况调查［J］.实用预防医学，2009，16(1):110－111.

［8］ Glynn SA，Wright DJ，Kleinman SH，et al.Dynamics of viremia in early hepatitis C virus infection［J］.Transfusion，2005，45(6):994 －1002.

［9］ 宋美兰，任芙蓉，龚晓燕，等.献血者 HBsAg及抗 HCV ELISA筛查不合格标本的假阳性分析［J］.北京医学，2013，35(5):391 －395.

［10］许晓绚，王宋兴，陈云龙，等.重组免疫印迹试验对3种进口抗HCV ELISA试剂组合应用的探讨［J］.中国输血杂志，2011，24(4):335 －336.

［11］刘保林，林海玉，黄国永，等.双抗原夹心ELISA法检测HCV抗体在无偿献血中的应用探讨［J］.北京医学，2013，35(11):968 －971.

［12］ He J，Xiu B，Wang G，et al.Double-antigen sandwich ELISA for the detection of anti-hepatitis C virus antibodies［J］.J Virol Methods，2011，171(1):163 －168.

［13］谢云峥，杨军，周国平，等.上海地区抗-HCV反应性献血者随访研究［J］.临床输血与检验，2013，15(32):212－216.

［14］ Acar A，Kemahli S，Altunay H，et al.The significance of repeat testing in Turkish blood donors screened with HBV HCV and HIV immunoassays and the importance of S/CO ratios in the interpretation of HCV/HIV screening test results and as a determinant for further confirmatory testing［J］.Transfus Med，2010，20(3):152 －159.

［15］任芙蓉，龚晓燕，李京京，等.献血员丙型肝炎病毒抗体酶免疫法检测试剂的测量值与其真阳性的相关性［J］.中华肝脏病杂志，2005，13(4):255 －258.

［16］张雪梅，黄珂，许茹，等.广州献血人群抗-HCV ELISA检测S/CO值与确证试验结果的相关性［J］.中国输血杂志，2013，26(1):29 －33.

［17］吴亚玲，祝宏，励晓涛，等.献血者抗-HCV阳性标本中RIBA确认情况的研究［J］.中国输血杂志，2010，23(11):940－942.

［18］ Pereira FM，Zarife MA，Reis EA，et al.Indeterminate RIBA results were associated with the absence of hepatitis C virus RNA(HCV-RNA)in blood donors［J］.Rev Soc Bras Med Trop，2014，47(1):12 －17.

［19］ Tulsiani S，Choudhury N，Desai P，et al.True positivity of anti-Hepatitis C Virus Enzyme-linked immunosorbent assay reactive blood donors:a prospective study done in western India［J］.Asian JTransfus Sci，2012，6(2):165 －168.

［20］杨燕，李洪波，单万水，等.122例丙肝抗体阳性血清核酸及抗体复检结果分析［J］.检验医学与临床，2013，10(增刊 I):39－41.

［21］ Makuria AT，Raghuraman S，Burbelo PD，et al.The clinical relevance of persistent RIBA indeterminate reactions:insights into the natural history of HCV infection and implications for donor counseling［J］.Transfusion，2012，52(9):1940 －1948.

［22］叶国强，汪小娟，刘香萍，等.HCV分片段抗原EIA与重组免疫印迹法分析检测HCV抗体的比较研究［J］.医学临床研究，2006，23(2):176 －178.

［23］余加宏，王南，刘林.ELISA法抗HCV阳性献血者分片段试剂和RT-PCR法检测结果分析［J］.淮海医药，2008，26(5):403－404.

［24］ Roth WK，Busch MP，Schuller A，et al.International survey on NAT testing of blood donations:expanding implementation and yield from 1999 to 2009［J］.Vox Sang，2012，102(1):82－90.

［25］吕蓉，盛琪琪，赵阳，等.核酸检测技术在安徽血液中心血液筛检中的应用分析［J］.安徽医学，2014，35(5):572－575.

［26］吴大先，刘菲，刘洪波，等.转录介导扩增技术检测慢性丙型肝炎患者血清中HCV RNA及与RT-PCR的比较［J］.中南大学学报，2014，39(7):664 －672.

［27］ Martins PP，Lampe E，Lewis-Ximenez LL，et al.Performance ofmolecularmethods for hepatitis C virus diagnosis:usefulness among chronic cases and during the course of infection［J］.Clin Lab，2013，59(9/10):1031 － 1039.

［28］谷金莲，于洋，梁争论.3种国产丙型肝炎病毒核酸定量与罗氏试剂检测性能的初步评价［J］.中国病毒病杂志，2013，3(6):445 －449.

［29］黄成垠，蒋昵真，朱绍汶，等.1种血液核酸筛查系统的应用评价［J］.中国输血杂志，2012，25(10):1010 －1011.

［30］刘峭梅，覃柳燕.献血者血液单人份核酸检测及血清学检测结果的分析［J］.检验医学与临床，2014，11(1):102－104.

［31］朱绍汶，陈显，王金花，等.2011－2012年南京地区无偿献血人群丙型肝炎病毒感染情况分析［J］.临床血液学杂志，2013，26(10)718 －720.

［32］ Makroo RN，Arora JS，Chowdhry M，et al.Red cell alloimmunization and infectious marker status(human immunodeficiency virus hepatitis B virus and hepatitis C virus)inmultiply transfused thalassemia patients of North India［J］.Indian JPathol Microbiol，2013，56(4):378 －383.

［33］巫贡晓，赖福春，施冬梅，等.核酸扩增技术在献血者血液筛查中的应用分析［J］.国际检验医学杂志，2013，34(19):2530－2532.

［34］曹志刚，李霜云.核酸检测技术在襄阳地区献血筛查中的应用分析［J］.临床输血与检验，2013，15(2):150 －151.

(2014－07－04收稿 2014－08－26修回)