二维液相色谱在中药分析的应用

黄竞怡，佟玲，丁黎

（1.中国药科大学药物分析教研室，江苏 南京210009；2.天士力制药集团股份有限公司研究院药物分析所，天津300402）

二维液相色谱在中药分析的应用

黄竞怡1,2，佟玲2，丁黎1*

（1.中国药科大学药物分析教研室，江苏 南京210009；2.天士力制药集团股份有限公司研究院药物分析所，天津300402）

中药的物质体系复杂，对其组分的分离、鉴定和制备需要更高的分离度，二维液相色谱能将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联构成分离系统，应用于复杂基质的中药材及中药复方制剂的分析，可显著提高峰容量和色谱峰鉴定的可靠性，降低色谱峰重叠，使分离效率与分析通量大为提高。综述二维液相色谱基本原理及其在中药分析中的应用研究新进展。

二维液相色谱；中药分析；分离度；峰容量

中药是一个复杂的物质体系，其组分的极性分布范围广泛，且各组分间的含量差异巨大[1]。传统的一维色谱分离度不够，对中药中微量化合物的分析会受到常量化合物的干扰，峰重叠现象严重[2]。二维液相色谱（2D-LC）是将分离机制不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统，通过柱切换技术实现样品在一维和二维色谱柱之间的流动。2D-LC分析时，样品被第一维色谱柱分离后进入切换阀的接口，再经捕集或切割后进入第二维色谱柱及后续检测器。20世纪80年代，Davis 和Giddings（Anal Chem，1983年）研究发现，当样品中的组分数超过整个系统峰容量（peak capacity）的37%时，色谱系统的分离度会大幅降低；若需完全分离样品中98%的组分，系统的峰容量要大于色谱峰数的100倍。Giddings（Anal Chem，1967年）的研究表明，2D-LC系统的分离度是1D-LC系统分离度平方和的平方根，峰容量是1D-LC系统峰容量的乘积（两者的分离能力见图1），2D-LC显著提高了分离能力， 降低了色谱峰重叠，两维不同的分离机理组合可实现复杂样品的高通量分析。

2 D-LC技术在脂质体分析[3]、蛋白质组学分析[4]、前体物质筛选[5]等生物样品复杂体系分析领域已得到广泛应用，近年来在中药质量控制领域也发挥了重要作用。

图1 一维液相色谱与二维液相色谱分离能力对比[2]Figure 1 Comparison of separation capacity between 1D-LC and 2D-LC

1 二维液相色谱的基础理论

1.1 正交性

在2D-LC系统中，正交性（orthogonality）（Erni等，J Chromatogr A，1978年）取决于每一维分离机制的相关性，是评价系统分离能力的重要指标。现有研究报道，2D-LC的正交性可用信息相似度（informational similarity，IS）（Liu等，Anal Chem，1995年）、 交互百分比（percentage of synentropy，PS）[6]、峰分布角（peak spreading angle）[7]和实际峰容量（Giddings，Anal Chem，1984年）表示。

提高2D-LC的正交性，主要有以下3种方法：①选择不同分离机制的色谱系统，根据分离对象和目的进行选择性组合；②选择合适的固定相[8]和流动相，兼顾两维流动相的相容性[9]；③优化合理的分析条件[10]。

1.2 峰容量

Giddings（Anal Chem，1984年）曾提出用峰容量描述色谱的分离能力。峰容量是指在一定分析时间内，能够在给定色谱系统中达到一定分离度的最大组分数。在2D-LC系统中，峰容量为每一维峰容量的线性组合，当两维的分离完全正交，且所有色谱峰随机分布在整个2D-LC系统中时，其峰容量等于两维的乘积，即P2D=P1×P2。

但2D-LC系统的实际峰容量往往低于这个值[11]，主要原因有：①两维分离模式并非完全正交；②第一维的采样速率不足，导致采样过疏（under-sampling）[12]。

2 二维液相色谱的分离模式

2 D-LC根据第一维馏分到第二维的转移方式可分为离线（off-line）2D-LC和在线（on-line）2D-LC两种模式[13]；根据第一维馏分是否全部转移到第二维可分为全2D-LC（comprehensive 2D-LC）和中心切割2D-LC（heart-cutting 2D-LC）两种模式（Bushey等，Anal Chem，1990年）；还可根据不同分离机制的色谱系统组合进行分类，如正相/反相色谱、反相/反相色谱、离子色谱、生物膜色谱/反相色谱、手性色谱/非手性色谱等。

2.1 离线模式和在线模式

离线模式[14]是通过手动或组分收集器获得组分后，进入第二维进行分析，对仪器的要求较低。在线模式[15]是通过接口切换将第一维洗脱组分直接注入第二维色谱柱，或是利用收集切换装置交替收集适量的第一维组分，且按照特定的时间间隔进行第二维分离。

离线模式具有溶剂选择范围广、操作简单等优点[16]，缺点是不具有连续性，收集后的组分大多需要富集浓缩，易造成样品的损失和污染，自动化程度不高。在线模式具有样品损失少、速度快和自动化程度高等优点[17]，缺点是溶剂的兼容性差，转换阀、环线及检测器的死体积易导致峰展宽现象。

2.2 全二维液相色谱和中心切割二维液相色谱

全2D-LC是让第一维的所有组分均进入到第二维分析，两根色谱柱通过接口连接，既保持了第一维的分离度和分离效率[18]，又能得到样品中全部组分的信息，适合复杂样品体系中未知组分[19]的分析。中心切割2D-LC[14]是让包含目标化合物的第一维组分选择性地进入第二维分析，可通过对目标组分选择性分析来缩短分析时间、提高分析效率，但需要在特定的分离

模式下选择合适的切割时机。

2.3 液相色谱分离机制的组合

根据样品的性质，可选择将正相色谱、反相色谱、离子交换色谱、手性色谱、高速逆流色谱等不同分离机制的色谱组合，实现不同的分离目的。此外，近年来新型色谱填料[20]的研制与开发也拓展了2D-LC的应用范围。

3 二维液相色谱在中药分析中的应用

中药复杂体系中成分的差异性和未知性为分离分析工作带来诸多难题，2D-LC技术与质谱（MS）技术联用（2D-LC-MS）[21]在复杂中药样品组成的分离分析和制备鉴定方面表现出良好的前景，现对2D-LC技术在中药材和中药复方制剂分析中的应用作一总结（见表1和表2）。

表1 2D-LC 在中药材分析中的应用实例Table1 Application examples of 2D-LC in the analysis of Chinese medicinal materials

续表1

表2 2D-LC 在中药制剂分析中的应用实例Table2 Application examples of 2D-LC in the analysis of TCM preparations

传统的1D-LC-MS系统受中药复杂基质产生的离子抑制效应（Davis 等，Anal Chem，1983年）影响，提供的化合物信息量大大减少，为此研究者们构建了各种2D-LC系统对复杂中药进行了分离，如红花[35]、大黄[36]、甘草[37]、六味地黄丸[40]、正天丸[42]、小儿清热止咳口服液[44]和复方银黄口服液[46]等（见表1和表2），通过比较峰容量和分离效果证实2D-LC技术相比1D-LC具有较高的分离效率。Zeng等[48]为比较1D-LC和2D-LC对复杂中药样品的分离鉴定能力，将降香、黄芩、半枝莲、枳壳、甘草和葛根6种中药混合后，

利用三根色谱柱构建了平行1D-LC和2D-LC对混合物进行分离，并对其中的黄酮类成分进行质谱鉴定，结果显示，2D-LC鉴定出25种黄酮，1D-LC仅鉴定出14种黄酮，2D-LC相比于1D-LC具有更高的分离效率。

针对中药材或中药复方制剂的研究，首先要阐明其化学物质基础，目前基于液相-质谱-数据库(LCMS-DS)/制备型液相色谱(pHPLC)的中药化学组分快速鉴别与制备技术已广泛应用于中药的物质基础研究。现有2D-LC技术对中药样品的分析已发展到制备级别，能获得在1D-LC上响应低、受基质影响大的化合物纯品，这极大地解决了分离制备的难题。Jin等[34]利用C3和C18色谱柱构建的2D-LC系统对忍冬的各成分进行分离和制备，结果获得了纯度大于99%的7个化合物，且用核磁共振鉴定了其结构。Qiu等[24]利用高速逆流色谱柱和制备脂质体色谱柱串联构建了2D-LC系统，对蟾酥各组分进行分离制备，获得了9种纯度大于85%的化合物，且通过核磁共振鉴定了其结构。Jayaprakasha等[31]利用硅胶快速色谱柱和硅胶/二醇色谱柱构建的2D-LC系统对姜黄中的姜黄素、去甲基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素和二氢双脱甲氧基姜黄素进行制备水平的分离分析，且与MS和定量核磁共振技术结合，鉴定了4种姜黄素其纯度均大于90%。陈岑[47]利用亲水作用色谱和反相色谱组合的离线2D-LC与MS系统联用，分离和鉴定栀子豉汤组方药材和全方的化学成分，包括16种环烯醚萜苷类和栀子黄色素类成分及11种大豆异黄酮类成分，通过比较方剂和单味药材之间有效成分的差异分析该中药组方特点。

近年来，基于新型填料、新型色谱分离机制发展起来的2D-LC技术应用于中药的分离分析，不仅极大地提高了系统峰容量、改善了峰重叠，且解决了两维流动相的兼容以及相同分离机制构建2D-LC体系正交性不足的问题。Xue等[36]构建了click dipeptide柱和C18柱的2D-LC系统对中药大黄进行分析，结果分离出400多个峰，而相同条件下，1D-LC仅分离出约60个峰。Liu等[35]发展了由麦芽糖柱作为第一维、酸胺柱和环糊精柱分别作为第二维的两个离线模式2D-Hilic/Hilic体系，并用于中药红花中的强极性组分分析，结果显示这两个2D-LC体系的峰容量分别为879和554，相同条件下1D-LC的峰容量仅为50。此外，高温色谱柱[37]、整体柱等[31]也被用于构建2D-LC体系对中药进行分析。

2 D-LC在中药活性组分筛选和分离方面也表现突出，通过一维生物活性色谱柱筛选具有活性的中药组分，再在第二维色谱柱上进行分离和分析，从而快速鉴定特定活性组分。Wang等[43]使用全二维人血清白蛋白柱/反相色谱柱（2D-HSA/RPLC）的液相色谱体系，分离分析传统中药龙胆泻肝汤剂，结果显示100多种与HSA有活性作用的组分被分离，其中的19种化合物通过MS推测了其结构。

4 展望

高自动化的分析仪器，灵活的柱结合切换方式，系统针对性的分离分析条件[38]，以及多维信息整合和处理平台是2D-LC的发展方向。2D-LC-MS凭借其强大的分离分析能力，在中药的分析和物质基础研究上的优势日益凸显，用于指导中药的分离制备，可大大提高其分离效率和组分纯度。相信随着新技术和新方法的发展和完善，2D-LC技术必将在中药分析领域有更加广阔的应用空间。

[1]Xie P S, Leung A Y.Understanding the traditional aspect of Chinese medicine in order to achieve meaningful quality control of Chinese materia medica[J].J Chromatogr A, 2009, 1216(11)： 1933-1940.

[2]Stoll D R, Li X, Wang X,et al.Fast, comprehensive two-dimensional liquid chromatography[J].J Chromatogr A, 2007, 1168(1/2)： 3-43.

[3]Wang S, Li J, Shi X,et al.A novel stop-flow two-dimensional liquid chromatography-mass spectrometry method for lipid analysis[J].J Chromatogr A, 2013, 1321： 65-72.

[4]Percy A J, Simon R, Chambers A G,et al.Enhanced sensitivity and multiplexing with 2D LC/MRM-MS and labeled standards for deeper

and more comprehensive protein quantitation[J].J Proteomics, 2014, 106： 113-124.

[5]Gandhi T, Fusetti F, Wiederhold E,et al.Apex peptide elution chain selection： a new strategy for selecting precursors in 2D-LC-MALDITOF/TOF experiments on complex biological samples[J].J Proteome Res, 2010, 9(11)： 5922-5928.

[6]Li X, Stoll D R, Carr P W.Equation for peak capacity estimation in two-Dimensional liquid chromatography[J].Anal Chem, 2009, 81(2)： 845-850.

[7]Van Gyseqhem E, Van Hemelryck S, Daszykowski M,et al.Determining orthogonal chromatographic systems prior to the development of methods to characterise impurities in drug substances[J].J Chromatogr A, 2003, 988(1)： 77-93.

[8]Liu Y, Guo Z, Feng J,et al.Development of orthogonal two-dimensional hydrophilic interaction chromatography systems with the introduction of novel stationary phases[J].J Sep Sci, 2009, 32(17)： 2871-2876.

[9]Qiu Y K, Yan X, Fang M J,et al.Two-dimensional countercurrent chromatography ×high performance liquid chromatography for preparative isolation of toad venom[J].J Chromatogr A, 2014, 1331： 80-89.

[10]Jandera P.Column selectivity for two-dimensional liquid chromatography[J].J Sep Sci, 2006, 29(12)： 1763-1783.

[11]Seeley J V.Theoretical study of incomplete sampling of the first dimension in comprehensive two-dimensional chromatography[J].J Chromatogr A, 2002, 962(1/2)： 21-27.

[12]Horie K, Kimura H, Ikegami T,et al.Calculating optimal modulation periods to maximize the peak capacity in two-dimensional HPLC[J].Anal Chem, 2007, 79(10)： 3764-3770.

[13]Dugo P, Favoino O, Tranchida P Q,et al.Off-line coupling of nonaqueous reversed-phase and silver ion high-performance liquid chromatography-mass spectrometry for the charaeterization of rice oil triaeylglycerol positional isomers[J].J Chromatogr A, 2004, 1041(1/2)：135-142.

[14]沈保家，秦昆明，刘启迪，等.二维色谱技术及其在中药领域中的应用[J].中国科学：化学，2013, 43 (11)： 1480-1489.

[15]马赛，梁琼麟，罗国安，等.在线全二维液相色谱质谱联用分析板蓝根注射液[J].南昌大学学报理科版，2006，30(Suppl)： 1383-1384.

[16]Eggink M, Romero W, Vreuls R J,et al.Development and optimization of a system for comprehensive two-dimensional liquid chromatography with UV and mass spectrometric detection for the separation of complex samples by multi-step gradient elution[J].J Chromatogr A, 2008, 1188(2)： 216-226.

[17]丁坤，吴大朋，关亚风.二维液相色谱接口技术[J].色谱，2010，12(28)： 1117-1122.

[18]Yan S K, Xin W F, Luo G A,et al.An approach to develop twodimensional fngerprint for the quality control ofQingkailinginjection by high-performance liquid chromatography with diode array detection[J].J Chromatogr A, 2005, 1090(1/2)： 90-97.

[19]Cacciola F, Jandera P, Hajdú Z,et al.Comprehensive two-dimensional liquid chromatography with parallel gradients for separation of phenolic and favone antioxidants[J].J Chromatogr A, 2007, 1149(1)： 73-87.

[20]Sun C X, Zhao Y Y, Curtis J M.Elucidation of phosphatidylcholine isomers using two dimensional liquid chromatography coupled in-line with ozonolysis mass spectrometry[J].J Chromatogr A, 2014, 1351： 37-45.

[21]屠鹏飞，史社坡，姜勇.中药物质基础研究思路与方法[J].中草药，2012，43(2)： 209-215.

[22]Hou X F, Yuan X L, Zhang B,et al.Screening active anti-breast cancer compounds from Cortex Magnolia offcinalis by 2D LC-MS[J].J Sep Sci, 2013, 36(4)： 706-712.

[23]Song Y L, Jing W H, Du G,et al.Qualitative analysis and enantiospecifc determination of angular-type pyranocoumarins in Peucedani Radix using achiral and chiral liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr A, 2014, 1338： 24-37.

[24]Qiu Y K, Yan X, Fang M J,et al.Two-dimensional countercurrent chromatography×high performance liquid chromatography for preparative isolationof toad venom[J].J Chromatogr A, 2014, 1331： 80-89.

[25]盛龙生，王颖，马仁玲，等.天然药物成分分析2D-LC/MS 技术平台的初步建立[J].中国天然药物，2003, 1(1)： 61-64.

[26]Zhang J, Tao D Y, Duan J C,et al.Separation and identification of

compounds in Adinandra nitida by comprehensive two-dimensional liquid chromatography coupled to atmospheric pressure chemical ionization source ion trap tandem mass spectrometry[J].Anal Bioanal Chem, 2006, 386(3)： 586-593.

[27]Wang Y, Lu X, Xu G W.Development of a comprehensive twodimensional hydrophilic interaction chromatography/quadrupole timeof-fight mass spectrometry system and its application in separation and identifcation of saponins fromQuillaja saponaria[J].J Chromatogr A, 2008, 1181(1/2)： 51-59.

[28]陈学国，胡良海，孔亮，等.全二维液相色谱-质谱联用用于金银花提取液的成分分析[C]//第十五次全国色谱学术报告会文集(下册).郑州：中国化学会色谱专业委员会和中国色谱学会, 2005：714-715.

[29]胡良海，陈学国，孔亮，等.整体柱用于全二维液相色谱/质谱快速分离当归提取物[C] //第十五次全国色谱学术报告会文集(下册).郑州： 中国化学会色谱专业委员会和中国色谱学会, 2005：712-713.

[30]Li K Y, Zhu W Y, Fu Q,et al.Purification of amide alkaloids from Piper longum L.using preparative two-dimensional normal-phase liquid chromatography reversed-phase liquid chromatography[J].Analyst, 2013, 138(11)： 3313-3320.

[31]Jayaprakasha G K, Nagana Gowdab G A, Marquez S,et al.Rapid separation and quantitation of curcuminoids combining pseudo twodimensional liquid fash chromatography and NMR spectroscopy[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2013, 937： 25-32.

[32]曾静，郭志谋，李伟，等.离线二维液相色谱-串联质谱法检测姜黄中姜黄素类和倍半萜类化合物[J].中国科学：化学，2010，40(6)： 768-774.

[33]Li B, Zhang X, Wang J,et al.Simultaneous characterization of fifty coumarins from the roots of angelica dahurica by off-line twodimensional high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Phytochem Anal, 2014, 25(3)： 229-240.

[34]Jin H L, Liu Y F, Feng J T,et al.Effcient purifcation of high-purity compounds from the stem of Lonicera japonica Thunb using twodimensional preparative chromatography[J].J Sep Sci, 2013, 36 (15)：2414-2420.

[35]Liu Y M, Guo Z M, Feng J T,et al.Development of orthogonal twodimensional hydrophilic interaction chromatography systems with the introduction of novel stationary phases[J].J Sep Sci, 2009, 32(17)：2871-2876.

[36]Xue M, Huang H, Ke Y,et al.“Click dipeptide”： a novel stationary phase applied in two-dimensional liquid chromatography[J].J Chromatogr A, 2009, 1216(49)： 8623-8629.

[37]田宏哲，徐静，关亚风.高温正相色谱/反相色谱 (HTNPLC/ RPLC)二维联用系统的构建与应用[J].分析测试学报, 2008, 27(7)：691-696.

[38]Xing Q Q, Liang T, Shen G B,et al.Comprehensive HILIC×RPLC with mass spectrometry detection for the analysis of saponins in Panax notoginseng[J].Analyst, 2013, 137(9)： 2239-2249.

[39]陈学国，孔亮，盛亮洪，等.全二维液相色谱串联质谱用于银杏叶提取物成分分析的研究[J].色谱, 2005, 23 (1)： 46-51.

[40]唐涛，张维冰，李彤，等.六味地黄丸组分的二维液相色谱分离[J].分析化学, 2007, 35(12)： 1767-1771.

[41]张艳海，张大伟，孟兆青，等.在线二维液相色谱法快速测定桂枝茯苓胶囊中芍药苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的含量[J].中国中药杂志, 2013, 38(23)： 4088-4093.

[42]兰韬，焦丰龙，唐涛，等.正相模式/反相模式的二维液相色谱系统的构建与应用[J].色谱, 2008, 26(3)： 374-377.

[43]Wang Y, Kong L, Hu L,et al.Biological fngerprinting analysis of the traditional Chinese prescription Longdan Xiegan Decoction by on/ off-line comprehensive two-dimensional biochromatography[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2007, 860(2)： 185-194.

[44]邹萍，王绍艳，张志强，等.二维高效液相色谱技术用于分析中药制剂中的麻黄类生物碱[J].分析测试学报, 2007, 26(1)： 120-121.

[45]郭菲，王彦，王刃锋，等.二维液相色谱-质谱联用分离中药复方葛根芩连汤中的有效成分[J].色谱, 2008, 26(1)： 15-21.

[46]刘文翔.二维液相色谱分离中药复方银黄口服液中的有效成分[J].河南化工, 2010, 27(12)： 41-43.

[47]陈岑.二维液相色谱-质谱联用技术在栀子豉汤成分分析中的应用研究[D].广东： 广东药学院, 2014： 71-90.

[48]Zeng J, Zhang X L, Guo Z M,et al.Separation and identification of favonoids from complex samples using off-line two-dimensional liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr A, 2012, 1220： 50-56.

Application of Two-dimensional Liquid Chromatography in Analysis of Traditional Chinese Medicines

HUANG Jingyi1,2, TONG Ling2, DING Li1
(1.Department of Pharmaceutical Analysis, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 2.Tasly Pharmaceutical Analysis Institute, Tianjin Tasly Group Co., Ltd., Tianjin 300402, China)

Traditional Chinese medicines (TCMs) are featured by high complexity of their components.Therefore, high chromatographic resolution is required for the separation, identifcation and preparation of those components in TCMs.Two-dimensional liquid chromatography (2DLC) is a separation system combining two independent columns with different separation mechanisms in tandem.When applied in the analysis of Chinese medicinal materials and compound preparations of TCMs with complex matrix, 2D-LC can improve peak capacity and reliability of peak identifcation, and reduce peak overlapping at the same time, signifcantly enhancing separation effciency and analysis throughput.The basic principles of 2D-LC and the recent progress in its application in the analysis of TCMs were reviewed.

two-dimensional chromatography; analysis of traditional Chinese medicines; resolution; peak capacity

R284.2

A

1001-5094（2015）05-0357-07

接受日期：2015-04-10

“十二五”科技重大专项“重大新药创新”项目（No.2013zx09402202）

*通讯作者：丁黎，教授，博士生导师；

研究方向：中药分析、体内药物分析、药物代谢动力学；

Tel：025-83271289； E-mail：dinglihg@sina.com