激肽释放酶-激肽系统的细胞内作用机制研究进展

石瑞峰综述，张仁良审校

0 引 言

激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kinin system，KKS)是生物体内重要的炎性调节系统，参与心血管、肾和中枢神经系统等各组织器官的炎症过程并与多种肿瘤的发生相关。激肽释放酶分为血浆型激肽释放酶(plasma kallikrein，PK)和组织型激肽释放酶(tissue kallirein，TK)。PK 特异地在肝细胞表达，而TK 广泛分布机体各组织中，是一大类的多基因家族。已发现至少有15 种人组织激肽释放基因(KLK1 ～KLK15)，其中KLK1 编码的组织激肽释放酶1 是产生激肽的主要物质。活化的TK 催化低分子量激肽原转化为激肽和缓激肽(bradykinin，BK)，后者作用于缓激肽B1受体(bradyldnin B1receptor，B1R)和B2R 发挥一系列生物效应，如内皮依赖性血管舒张、非血管平滑肌收缩、炎症反应及疼痛等。在生理及病理状态下，B2R 激活能够减轻组织损伤，促进血管新生和靶器官功能恢复等。在应激状况(如缺血缺氧、炎症及外伤等)下，B1R 激活能够促进早期炎性因子的释放，增强炎症反应，加重缺血后组织水肿进而加剧组织损伤。此外，TK 还可直接激活缓激肽受体发挥作用，也可通过非缓激肽受体如蛋白激活酶受体发挥生物学效应［1］。KKS通过多条细胞内通路参与机体的生理及病理过程。研究显示，即使病理状态相似，不同组织器官KKS发挥作用的细胞内信号通路也不尽相同。本文就KKS 在糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)、神经系统及心血管系统缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤、血管重构及动脉粥样硬化性狭窄等病理过程中的细胞内作用机制进行综述。

1 KKS 与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路

MAPK 是哺乳动物体内广泛存在的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，可以被一系列细胞外信号或刺激所激活，如物理应激、炎性细胞因子、生长因子、细菌复合物等。活化的MAPK 通过磷酸化核转录因子、细胞骨架蛋白及酶类等参与细胞增殖、分化及凋亡的调节，并与炎症、肿瘤等多种疾病的发生密切相关。MAPK 的主要途径包括Ras-Raf-ERK 途径、JNK 途径、p38MAPK 途径以及ERK5/BMK1 途径。

DN 是糖尿病(diabete mellitus，DM)常见的微血管并发症之一。在高血糖和DM 患者肾组织的近曲小管上皮细胞中，KLK1 表达上调［2］。Tang 等［3］发现高血糖可通过BK 激活p42/p44MAPK 信号通路，也可以不依赖BK 直接激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)信号通路从而促进肾小管发生炎症、纤维化及血管再生。Tan 等［4-5］的研究显示BK通过B2R 激活p42/p44 MAPK 信号通路，调节肾系膜细胞中结缔组织生长因子、TGF-βRII 表达显著升高，加重DM 动物肾损伤，靶向敲除B2R 可降低肾小球和肾小管的损伤，延缓DM 小鼠肾损伤的进展。在近曲小管上皮细胞中，TK 可通过激活p42/44 及p38 MAPK 信号通路，促进炎性细胞因子的产生。此外，Xu 等［6］发现，外源性BK 通过MEK/MAPK 和PI3K/Akt 信号通路能够抑制肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导的NIT-1 胰岛β 细胞凋亡。

大量研究已经证实MAPK 信号通路在离体神经元缺血/缺氧性损伤中起保护作用［7-10］。正常情况下，神经元B1R 表达低，B2R 表达相对较高。唐敏等［11］发现离体皮层神经元经氧-葡萄糖剥夺(oxgen-glucose deprivation，OGD)处理后再恢复氧和葡萄糖过程中，B1R 和B2R 表达明显升高。B1R主要与JNK 和p38 通路激活有关，而B2R 则与ERK1/2 通路激活和JNK 通路的抑制有关。TK 通过B2R 激活ERK1/2 信号通路减轻谷氨酸盐或酸中毒介导的皮层神经元损伤，促进神经元的存活。BK通过B2R 激活ERK1/2 信号通路可抑制OGD 诱导的神经元凋亡［11］。最近研究报道TK 通过B2R 激活Raf-MEK1/2-ERK1/2 路径，减轻大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1 区神经元损伤［12］。

Yan 等［13］发现将人类TK(human Tissue kallirein，hTK)基因导入原发性高血压大鼠模型和体外培养的人类胚胎肾293 细胞(HEK293)，通过活化ERK1/2 和PI3K/AKT 信号通路，提高凋亡抑制蛋白bcl-2 及bcl-xL 的表达水平、降低Bax 的水平及caspase-3 的活性，从而促进细胞存活及增殖，降低自发性高血压大鼠靶器官细胞凋亡［14-15］。

2 KKS 与磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol 3-kinase PI3K)/Akt/糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)通路

PI3K/Akt 信号通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径，在心脏、肾和肝等多种器官缺血再灌注损伤中具有抑制细胞凋亡作用。GSK-3 是PI3K/Akt 通路的下游分子，除参与糖代谢外，还参与细胞的分化、增殖和凋亡。GSK-3 主要有2 种亚型:GSK-3α 和GSK-3β，其中GSK-3β 可通过激活Caspase 家族及Bax 凋亡基因诱导细胞凋亡。

心肌细胞缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤是急性心肌梗死和缺血后心力衰竭的病理机制，而B2R 激活在心肌缺血性损伤中起重要的保护作用。在低氧或缺血期间，冠状动脉血流中的BK 持续产生，血浓度持续升高，同时B1R 和B2R 表达上调。Juhaszova 等［16］发现，I/R 时BK 通过激活B2R抑制心肌GSK-3β 活性调节线粒体通透性转换孔的开放，发挥保护作用。Yin 等［17］发现KKS 通过激活Akt-Bad-14-3-3 及Akt-GSK-3β-caspase-3 信号通路保护I/R 的心肌细胞。Yao 等［18］将腺病毒hTK 导入发生心肌I/R 的大鼠体后，大鼠心肌细胞中表达的TK 通过激活B2R 提高Akt 和GSK-3β 的磷酸化降低GSK-3β 活性，促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)表达，提高梗死组织周边心肌毛细血管及小动脉的密度，增加局部血流，减少心肌梗死面积。Yao 等［18］还发现TK 干预离体培养的人主动脉内皮细胞，能够促进毛细血管形成以及细胞迁徙增多，而B2R 拮抗剂、显性活性突变体GSK-3β、VEGF 中和抗体及VEGFR 抑制剂能够阻断TK的作用。Potier 等［19］研究发现，B2R 激动剂通过激活PI3K/Akt 通路，抑制GSK-3β 活化，减少非糖尿病小鼠心肌I/R 后梗死面积;而B1R 激动剂通过PI3K/Akt 和ERK1/2 通路，促进GSK-3β 失活，从而降低1 型DM 小鼠缺血损伤后心肌梗死面积。然而，B1R 激动剂对非糖尿病小鼠以及B2R 激动剂对糖尿病小鼠的心肌缺血性损伤均无保护作用。

Kim 等［20］通过体外培养人脐静脉内皮细胞研究发现，TK 激活B2R 促进Akt/GSK-3β 磷酸化而失活，进而提高β-catenin 水平，增加内皮细胞VEGF和VEGFR-2 的表达，促进毛细血管生成。Yao等［18］报道TK 干预能够增强缺血心肌和离体内皮细胞内Akt/GSK 磷酸化，以及VEGF 和VEGFR-2 表达，进而促进组织中血管再生。因此，TK 通过促进GSK-3β 磷酸化使其活性降低，从而促进血管再生，减轻缺血再灌注心肌损伤。

3 KKS 与一氧化氮(nitric oxide，NO)通路

BK 和胰激肽是最强效的血管舒张因子，通过激活外周及冠状动脉内皮细胞上B1R 和B2R 释放NO、前列环素以及内皮衍生的超极化因子，从而触发“NO 级联反应”。B2R 激活内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)促进NO 的释放，而B1R 激活后通过Ca2+依赖性诱导型NOS(induced NOS，iNOS)促进NO 的释放［21］。人血管内皮细胞上的B1R、B2R 激活后，通过不同NOS 亚型产生NO。B2R 介导正常内皮细胞短暂(5 min)释放NO，而经细胞因子处理后的内皮细胞，则主要通过激活B1R 产生持久(90 min)且大量NO［22］。

NO 主要通过血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)诱导其生成环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)，产生强大的血管舒张作用，进而保护各器官免受缺血再灌注损伤［21］。Emanueli 等［23］发现将TK 基因导入后肢缺血的动物，可直接通过内皮细胞内Akt 和eNOS 通路诱导血管再生。Chao［1］综合分析近年来关于TK的研究报道发现，TK 通过B2R 激活Akt-GSK-3β-VEGF-VEGFR2 以及Akt-eNOS-NO 信号通路促进心脏和肾脏的血管生成。

Chao 等［24］发现，激肽原缺乏的大鼠发生急性心肌梗死后，通过局部注射TK 可直接激活B2R，提高NO 水平，抑制单核/巨噬细胞在缺血心肌的聚集，抑制心肌细胞凋亡，降低梗死面积。在离体心肌细胞中，活化的激肽释放酶也可直接激活B2R，促进NO 形成，从而降低OGD 诱导的细胞凋亡。

Xia 等［25］将载有hTK 的腺病毒导入I/R 大鼠侧脑室发现，脑组织内TK 表达增高，同时伴有Akt-Bcl-2 信号通路激活，脑组织内NO 水平升高，氧化应激反应降低，胶质细胞迁移至缺血半暗带及核心区增多以及神经元凋亡减少，显著降低动物术后9 d时的神经功能缺损评分和脑梗死面积。

血管内皮细胞释放的生长因子和血管活性物质能诱导细胞增殖、迁移、死亡以及细胞基质沉淀。研究发现激肽与血管内皮细胞上B2R 结合通过促进NO 和PGI2释放，进而提高VSMCs 内cGMP 和环腺苷酸(cAMP)水平，抑制VSMCs 的增殖和迁移［26］。研究报道hTK 基因导入可通过B2R 能够抑制大鼠动脉球囊成形术后VSMCs 生长和内膜新生［27］，以及小鼠颈总动脉结扎诱导的新生内膜形成［28］。这些研究表明KKS 在血管重构及动脉粥样硬化性狭窄中可能起保护性作用。

4 KKS 与Janus 激酶(Janus kinases，JAKs)/转录激活因子(signal transducer and activator of transcription，STATs)通路

JAKs 是一种蛋白酪氨酸激酶，信号转导及STATs 是JAKs 的直接底物，能将信号传递到核内，调节特定基因的表达，两者构成JAK/STAT 信号转导通路［29］。Ju 等［30］发现BK 既可通过激活JAK 家族中的酪氨酸激酶Tyk2，促进酪氨酸磷酸化以及STAT3 核转录，也可通过激活p42/44MAPK，促进STAT3 丝氨酸磷酸化，调节培养牛主动脉内皮细胞生理功能。Na+/H+交换泵(Na+/H+exchanger isoform 1，NHE-1)普遍存在于哺乳动物细胞中，参与细胞体积、生长、细胞内pH 值的调节等生理作用以及融骨或者肿瘤侵袭等病理过程。Mukhin 等［31］通过体外培养的小鼠肾内髓集合管上皮细胞系mIMCD-3 细胞株，发现BK 可以剂量依赖性迅速激活NHE-1，而这种激活作用可被B2R 抑制剂、磷脂酶C抑制剂、CaM 抑制剂以及JAK2 抑制剂所阻滞，而PKC 和PI3K 却不能抑制。Lefler 等［32］发现，BK 通过B2R 而非B1R 激活KNRK(大鼠肾细胞)和CHO(中国仓鼠卵巢细胞)2 种细胞系的NHE，而Jak2 抑制剂AG490 和CaM 抑制剂W-7 均能降低BK 对NHE 的影响，因此他们认为，B2R 通过促进Jak2 及其下游的CaM 活化而影响NHE 的活动。上述研究结果显示，BK 通过活化JAK/STAT 信号转导通路不仅参与内皮细胞的生理功能调节，也能够影响NHE-1 的活动。

5 KKS 与线粒体氧化应激的相互作用

线粒体是多种促细胞凋亡信号转导分子的作用靶点。在各种促凋亡分子的作用下线粒体通透性转变孔不可逆地过度开放，导致线粒体内膜肿胀，线粒体膜间隙的细胞色素C 释放入细胞质，与凋亡蛋白酶活化因子形成多聚复合体，募集caspase-9 前体，活化并启动caspase 级联反应而引发凋亡［33］。Wang 等［12］发现TK 预处理，通过提高核转录因子kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)的表达，抑制caspase-3 的活性，降低细胞色素c 及bax 从线粒体中释放，能够降低大鼠脑缺血时神经元损伤。Kakoki［34］通过对野生型、B2R 敲除型、B1R/B2R 均敲除型小鼠行双侧肾动脉结扎后再灌注的研究发现，B1R/B2R 均敲除型小鼠发生DNA 氧化损伤、线粒体DNA 缺失、凋亡以及TGF-β1、CTGF 和ET-1 等氧化应激失调相关改变发生率增加最高，而野生型增加最少，因此认为B1R、B2R 对肾脏I/R 损伤有保护作用。Brown 等［35］发现，NO 通过抑制细胞色素c从离体星形胶质细胞中释放，从而可逆性抑制线粒体氧化代谢。因此，KKS 可能通过促进NO 和PGs的产生、抑制细胞色素C 的释放而降低线粒体氧化应激反应。

6 KKS 与蛋白酶活化受体(protease activated receptors，PARs)作用

大量研究已经证实TK 主要通过激肽受体信号产生生物学功能，但是最近的研究发现TK 也可激活PARs 在炎症或者心血管疾病方面发挥作用。PARs 是G 蛋白偶联受体家族中的亚型，共有4 种成员，其中PAR-1 和PAR-3 主要由凝血酶激活，PAR-2 由胰蛋白酶激活，PAR-4 可被上述2 种酶激活［36］。Gao 等［37］在培养人角化细胞迁移及大鼠皮肤损伤模型中的研究发现，TK 通过激活PAR1-PKCSrc-MMP 信号通路、表皮生长因子受体的反式转录促进角化细胞迁移和皮肤愈合。Houle 等［38］研究发现，小鼠足底注射PAR4 激动剂后引起的皮肤炎症反应依赖于中性粒细胞的聚集以及KKS 的成分。Yiu 等［36］发现TK 能够诱导离体培养的DN 患者近曲小管上皮细胞PAR-4 表达。PAR-4 活化后促进肾近曲小管上皮细胞发生炎性反应和纤维化;阻滞PAR-4 后，高血糖诱导的白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、CCL-2、CTGF 及IV 胶原蛋白表达均降低;而通过siRNA 去除近曲小管细胞内源性TK 分子后，细胞内晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGE)诱导的IL-8 和ICAM-1 生成减少。因此，在DN 的肾近曲小管上皮细胞内，TK 上调可能参与促炎反应和PARs 的激活。McDougall等［39］发现激活PAR4 可引起膝关节发生与KKS 相关的促炎反应。总之，PARs 的激活既可促进角化细胞的迁移和损伤皮肤的愈合，也可加重骨关节炎或者DN 病变的炎症反应。

7 结 语

KKS 是由多种成员组成的复杂的炎性调节系统，不同成员可能通过多种细胞内途径，参与各种病理生理过程如高血压病、缺血性心脑血管疾病、DM 及其并发症等，它们既可产生有利机体的保护作用，也可能同时产生不利于机体的伤害性作用，同一成员在不同靶器官的同一病理过程中可能起完全相反的作用。因此，仍需详尽研究KKS 不同成员在同一疾病的发生发展过程中的作用及其作用机制。帮助临床工作人员，根据靶器官和病理环境选择应用不同的KKS 成员进行干预，从而为优化临床治疗方案提供理论指导。

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