腺病毒载体的研究进展

刘　阳(综述),杜联芳(审校)

(上海交通大学附属第一人民医院超声科，上海 200080)

腺病毒载体的研究进展

刘阳△(综述),杜联芳※(审校)

(上海交通大学附属第一人民医院超声科，上海 200080)

摘要：基因治疗正在成为肿瘤治疗的有效手段，用于携带外源基因的载体在肿瘤的基因治疗中发挥了重要作用。其中腺病毒载体因宿主范围广、感染率高、病毒相对容易制备且不会与受染细胞发生整合等诸多优点，成为基因治疗中应用最为广泛的载体系统。肿瘤的基因病毒治疗是指在肿瘤特异性增殖病毒中加入抗癌基因，将肿瘤的基因治疗与病毒治疗各自的优势结合起来，可靶向杀伤肿瘤细胞，保护正常细胞免受严重伤害。

关键词：基因治疗；腺病毒载体；靶向转导；基因病毒治疗

基因治疗是一项治疗恶性肿瘤的新策略，它将一段具有外源功能的基因导入至肿瘤细胞从而补偿其基因缺失，达到抑制或杀伤肿瘤细胞的目的[1]。近年来，随着肿瘤分子生物学的发展以及人们对肿瘤病因、分子机制的不断深入研究，肿瘤基因治疗也日趋成熟。由于肿瘤基因治疗直接针对疾病根源，在恶性肿瘤治疗方面较传统治疗方法显示出独特的优势，成为攻克恶性肿瘤领域的研究热点，因而越来越受到医学科研界的关注。现对腺病毒载体的研究进展进行综述。

1腺病毒载体的分类及特点

基因转运技术是肿瘤基因治疗的重要环节之一，因此寻找合适的基因转运载体一直是研究的热点。由于腺病毒载体具有诸多独特的优点，已被广泛应用于人类疾病的基因治疗。腺病毒是一种无被膜的二十面体病毒，目前已发现有50余种血清型，其中2型和5型研究得较多。腺病毒通过纤维蛋白与感染细胞表面的柯萨奇腺病毒受体结合继而进入细胞。在人体，柯萨奇腺病毒受体表达于各种正常上皮组织，但在许多肿瘤组织中存在柯萨奇腺病毒受体不同程度的下调或缺失[2-3]。因此，通过构建肿瘤靶向性腺病毒载体，实现腺病毒对肿瘤细胞的靶向感染，从而完成目的基因的靶向转导[3]。目前，腺病毒载体根据杀伤肿瘤细胞的作用机制不同分为两类：复制缺陷型腺病毒和条件复制型腺病毒。

1.1复制缺陷型腺病毒复制缺陷型腺病毒能起到运输载体，携带外源基因(抑癌基因、自杀基因等)的作用，将这些外源基因靶向转导至肿瘤细胞，从而引起细胞死亡[4]。C系中的2型和5型人类复制缺陷型腺病毒载体由于以下优势成为基因治疗，特别是肿瘤基因治疗的常用传递工具：其在体内稳定存在，可插入较大的外源基因片段，容易制备且病毒滴度较高，宿主范围广，对许多分化和非分化细胞均具有较高的基因转导率，且不会整合入宿主基因组，在具有免疫活性的人体内不会导致严重疾病。但复制缺陷型腺病毒表达外源基因的时间相对较短，这是由于该病毒没有复制能力以及机体免疫系统的清除作用造成的[5]。

1.2条件复制型腺病毒条件复制型腺病毒能以高度的特异性在靶细胞中增殖并最终裂解该细胞，同时释放出子代病毒再感染邻近的肿瘤细胞，直至杀死所有肿瘤细胞，而对非靶细胞无杀伤作用[6]。近年来，特异性肿瘤细胞内条件复制型腺病毒成为研究热点，显示出强大而特异的杀伤肿瘤细胞效应[7]。

正常细胞和肿瘤细胞存在差异表达的基因，有些基因在正常细胞内是病毒复制及增殖所必需的，但在肿瘤细胞内却可以缺失，去除这些基因有望控制病毒仅在肿瘤细胞内表达，而对正常细胞无影响。另一种方法就是利用肿瘤特异性启动子调控病毒复制所必需的基因，如E1A、E1B基因[8]。将肿瘤特异性启动子插入至腺病毒复制必需基因E1A的上游，使该基因仅在肿瘤细胞内表达，而在其他细胞中不表达，如前列腺癌特异抗原启动子、肝癌甲胎蛋白启动子、结肠癌癌胚抗原启动子等，但这些启动子活性较弱，仅能针对特定组织起源的肿瘤，不能广泛应用于大多数肿瘤的治疗[9]。另外，还有一种广谱的肿瘤特异性启动子hTERT。第三种方法是构建嵌合型的腺病毒载体，使其不依赖于细胞表面的柯萨奇腺病毒受体，而通过肿瘤细胞表面其他特异性高表达受体进入细胞，从而大大提高与肿瘤细胞的结合能力。

2腺病毒载体的应用现状

基因的靶向转导是通过载体与肿瘤细胞表面特有受体之间的特异识别完成的。实现特定细胞的靶向性，抗体与重组抗体结合域很有可能起重要作用，因为它们具有极好的亲和力和特定的结合靶细胞表面受体的功能。在此基础上，开发带有遗传学上抗体衍生部分的腺病毒载体一直是研究者的长期目标。虽然可以利用具有遗传作用的衣壳蛋白整合靶向配体(如单链抗体和生长因子)，然而却被靶向配体和腺病毒衣壳蛋白之间内在的生物不兼容性所严重阻碍。腺病毒衣壳蛋白的翻译和折叠发生在由于核转运和核内病毒体组装导致的细胞质不断减少的环境中[10]，与此相反，单链抗体的合成则发生在内质网的有氧环境中，然后通过高尔基体的连续分泌运送到细胞表面[11]。因此，腺病毒衣壳-单链抗体融合蛋白的细胞质途径抑制具有抗原识别能力的单链抗体的正确折叠，同时也减少了腺病毒病毒体的组装和复制[12]。

目前的研究热点是单链抗体靶向腺病毒载体对分泌的单链抗体的翻译后修饰。单链抗体靶向腺病毒载体的实现是通过腺病毒与靶向单链抗体高度特异的结合，单链抗体利用合成的亮氨酸拉链样二聚体结构域与腺病毒衣壳蛋白在结构相容性上达到最优化，从而使两者更好地结合[13]。研究结果表明，包含拉链结构的腺病毒纤维分子三聚体整合到成熟病毒体中，在不需要切除靶向识别的情况下，拉链结构就可以与抗体达到基因上的融合[10-12]。更重要的是，实验证明拉链标记的病毒体和单链抗体可以提供特定靶向的基因转导[14]。

单链抗体靶向腺病毒载体的研究描述了一种新的途径，即利用分泌的单链抗体分子来生产靶向的腺病毒载体，避免腺病毒与一种复杂的靶向配体之间在结构及生物上的不兼容性。这种方法通过使用种类繁多的靶向配体直接与多样的细胞受体结合，使腺病毒靶向作用变得更加容易。

目前，腺病毒载体介导基因转导仍面临两大难题：①某些靶细胞表面与腺病毒特异结合的受体表达不足或缺失，使腺病毒载体不能将目的基因有效地导入这些细胞(如肿瘤细胞、造血干细胞、树突状细胞等)，从而导致转染效率较低；②缺乏靶向性。由于腺病毒的宿主范围较广，在感染靶组织的同时也能感染其他正常组织，在体内应用时存在明显的组织细胞非特异性分布，特别是易在肝脏内聚集，产生不良反应[15]。以上问题随着腺病毒在临床实践中的应用而日见突出，因此，临床应用时大都直接或通过介入方式将腺病毒注射到肿瘤内，但是大量的腺病毒仍然会泄漏到循环血液中，产生非特异性分布[16]。这一问题已成为制约腺病毒在基因治疗临床实践中广泛应用的瓶颈，迫切需要提高腺病毒载体的靶向性,构建针对特定组织、细胞的靶向性腺病毒。

3溶瘤腺病毒及肿瘤的靶向基因病毒治疗

溶瘤病毒又称肿瘤增殖型病毒，近年来，溶瘤腺病毒作为潜在的肿瘤治疗方法被不断研究，溶瘤腺病毒载体可靶向地在肿瘤细胞内复制数百倍到数千倍，其所携带的基因也可增加数百到数千倍，故大大增强了其对肿瘤细胞的杀伤性和特异性，其机制是通过直接溶解、分泌毒性蛋白以及激发免疫疫苗反应等，与传统化疗及放疗的作用机制完全不同，几乎无交叉耐受性[17]。2001年，Kirn等[18]提出“病毒治疗”这一概念，但单用病毒治疗杀伤力不足。在肿瘤特异性增殖病毒中加入抗肿瘤基因，将肿瘤的基因治疗与病毒治疗各自的优势结合起来，这就是刘新垣[19]倡导的一种肿瘤治疗新策略——癌症的靶向基因病毒治疗。该方法克服了传统肿瘤基因治疗转染率低、靶向性杀伤肿瘤细胞能力差的缺点[20-21]。

溶瘤腺病毒特异性感染肿瘤细胞并在肿瘤细胞中大量复制，最终裂解肿瘤细胞并释放出子代病毒以感染更多的肿瘤细胞，从而形成了感染、复制、裂解、再感染的多重无限循环，同时这些病毒因无法在正常机体细胞内复制而不具有杀伤作用，理论上溶瘤病毒具有更高的抗肿瘤效应和更低的不良反应，溶瘤腺病毒载体还可以携带治疗基因，该治疗基因可随着病毒复制不断表达，从而起到叠加的抑瘤效果[21-22]。此外，病毒在肿瘤细胞内的复制通过诱导细胞因子和肿瘤抗原的释放，可能有助于调动免疫系统。许多临床试验都是基于溶瘤病毒进行的，目前已研制成功并已在肿瘤临床研究中应用的主要有腺病毒、新城疫病毒、单纯疱疹病毒1、呼吸道肠道病毒等，其中腺病毒基因的结构及其表达调控研究得较为深入[23]。

人类C系5型腺病毒的很多特征使其成为一个特别具有吸引力的溶瘤病毒构建平台，而不会导致任何严重疾病，并且人类C系5型腺病毒基因组已经被很好地特征化，允许相对简单的基因修饰[24]。据此，对衣壳蛋白特别是纤维做了修饰，从而能高效而特异地感染肿瘤细胞。最后它可以增长到高滴度，相对稳定地存在于循环的血液中，从而提高对远处转移治疗的可能性。

4条件复制型腺病毒的应用价值

条件复制型腺病毒作为肿瘤病毒治疗的作用剂有很多优势且被安全地应用于人类临床试验中，然而，其在溶瘤能力方面存在局限性，因此其效能还有待提高[25]。为此，条件复制型腺病毒被设计来表达具有治疗作用的转基因，其抗肿瘤作用的发挥与病毒直接溶瘤作用无关。在自身基因控制元素下这些转基因被表达，这种情况下，转基因在基因组中的位置决定了表达谱，或者它们能被外源启动子所控制。用于包装复制型腺病毒的治疗转基因大致可以分成3类：①介导杀死受感染的细胞；②调制肿瘤微环境；③具有免疫调节功能[26]。总体而言，对动物模型的研究，迄今结果已表明，选择合适的治疗转基因包装条件复制型腺病毒能提高其抗肿瘤效能。然而，要充分发挥包装的条件复制型腺病毒在人类临床中的作用，必须克服许多障碍。因此，通过静脉注射直接扩散到癌细胞已成为目前的研究热点，既克服了免疫反应，也增强了体内生物分布的监视以及包装的条件复制型腺病毒的活性。

5结语

近年来，腺病毒载体的发展已取得不错的成果，多种能够靶向感染肿瘤细胞且具有肿瘤杀伤性的重组腺病毒正在被研发[27]。虽然有很多研究成果已经进入了临床试验阶段，但是由于一些不可控因素，目前还没有很理想的可应用于临床的肿瘤基因治疗药物。但随着腺病毒研究的深入以及相关学科的发展，相信在不久的将来，利用腺病毒载体基因治疗肿瘤将会成为手术、化疗、放疗的补充治疗手段，并将成为生物治疗的常规方法。

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Research Progress of Adenovirus VectorLIUYang,DULian-fang.(DepartmentofUltrasound,ShanghaiJiaotongUniversityAffiliatedFirstPeople′sHospital,Shanghai200080,China)

Abstract:Gene therapy is becoming an effective mean of cancer treatment,and the carrier carrying exogenous gene has played an important role in tumor gene therapy.Adenovirus vector has many advantages,such as a wide range of hosts,high infection rate,easier to prepare and won′t be integrated into infected cells.Therefore,it has become the most widely used gene-carrier system.Adding anti-cancer gene into tumor-specific proliferation virus,banding together the advantages of gene therapy and virus therapy,known as gene-virotherapy,has an advantage of targeted killing of tumor cells while protecting normal cells from serious injury.

Key words:Gene therapy; Adenovirus vector; Targeted transduction; Gene-virotherapy

收稿日期：2015-02-05修回日期：2015-06-04编辑：相丹峰

基金项目：国家自然科学基金(81171352；81271596)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.008

中图分类号：R730.59

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)24-4438-03