神经干细胞移植治疗创伤性颅脑损伤的实验进展

刘吉星，侯博儒，杨文桢(综述)，任海军(审校)

(兰州大学第二医院神经外科，兰州 730030)

神经干细胞移植治疗创伤性颅脑损伤的实验进展

刘吉星△，侯博儒，杨文桢(综述)，任海军※(审校)

(兰州大学第二医院神经外科，兰州 730030)

摘要：神经干细胞(NSCs)存在于中枢神经系统内，是一类具有永生增殖能力和多向分化潜能的细胞。动物实验表明，创伤性颅脑损伤(TBI)后行NSCs移植治疗可改善受损的运动、感觉等神经的功能以及认知功能，还能在一定程度上抑制早期神经炎症和病情的进展。NSCs在TBI的治疗中应用前景广阔，但其作用机制复杂，仍面临着来源、增殖分化调控、安全性、神经环路重建等问题，还有待进一步的研究。

关键词：创伤性颅脑损伤；神经干细胞；动物模型；移植

创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是神经外科常见疾病之一，是导致<45岁个体死亡的首要原因，并有着较高的致残率。最近一项流行病学调查显示，儿童和青少年TBI后致残率>20%[1]。目前，对TBI所致中枢神经系统功能损害的治疗主要是采用神经营养及神经康复，但由于TBI后受损神经元难以自我修复，且机体很难产生新的功能性神经元，因而难以取得理想疗效。在过去的30年中，人们建立TBI动物模型观察并分析TBI后的病理生理变化，以探索行之有效的治疗方法，但在TBI动物实验中被认为有效的神经保护剂，大部分在后续的Ⅱ、Ⅲ期临床试验中失败，由此需要重新考虑TBI的动物实验模型，并适时调整研究策略和治疗方法[2]。近年来神经干细胞(neural stem cells，NSCs)移植治疗TBI逐渐成为热点之一，现对NSCs治疗TBI的实验进展予以综述。

1NSCs移植治疗实验中常采用的TBI动物模型

1.1 液体冲击伤(fluid percussion injury，FPI)模型 模型液压装置由有机玻璃管、钟摆打击装置、示波器以及压力传感器组成，有机玻璃管接活塞，另一端接打击管和压力传感器，管道内用37 ℃生理盐水密封，调整打击锤下落高度，撞击活塞推动液体前进，经打击管传导至颅。打击使脑组织出现短暂的移位和变形，损伤的严重程度取决于压力脉冲的强度。FPI可复制无颅骨骨折的TBI，中度至重度TBI往往与颅骨骨折和挫伤跨多个脑回相联系，而FBI不能复制这些，但FPI能复制TBI病理生理学特征性变化，如：局灶性皮质挫伤和弥漫性的(如海马和丘脑)皮质下神经元损伤、颅内出血、脑肿胀以及进行性灰质损伤[3]。多次轻微的PFI可导致长期累积效应——慢性神经炎症、皮质缺失，并产生神经行为和认知功能障碍如运动障碍、记忆障碍、癫痫以及精神异常等[4]。FPI通常选择在大鼠前囟与人字缝间、矢状缝外侧>3.5 mm的位置进行，相比其他模型，FPI具有较高的死亡率，这可能是因为高液压作用于该区域引起下丘脑综合征或波及脑干而发生呼吸暂停[5]。FPI模型的脑损伤机制与人TBI不尽一致，无法全面反映人TBI，不适于TBI的生物力学研究。

1.2自由落体撞击模型 自由落体撞击伤模型由Scott于1940年建立并用于脑损伤研究[6]，后经改良而常用于复制闭合性加速性颅脑创伤，其中Feeney模型和Marmarou模型应用较为广泛。自由落体模型需要暴露颅骨，脑损伤程度可通过调整自由落体的重物重量和高度控制[7]。Feeney模型需要开颅去除打击部位的颅骨，使自由落体的撞击力传递到完整的硬脑膜，并造成皮质挫伤。形态学上，这些损伤在伤后1 h表现为挫伤皮质下白质区的出血，并在未来24 h内直接进展为坏死腔，在接下来的2周内坏死腔可能会向周围扩展。Marmarou等[8]创建了弥散性轴突损伤(diffuse axonal injury，DAI)模型——Marmarou撞击加速模型以模仿人类高处坠落或交通事故引起的DAI。在这一模型中，大鼠被置于海绵床上，沿正中线切开头皮显露颅骨，不锈钢垫片固定于颅骨中央、人字点与前囱之间。Marmarou模型可引起双侧大脑广泛的神经元、轴突、树突、微血管系统损伤，尤其是胼胝体、内囊、视束、大脑脚、脑干的长束等部位，其缺点是损伤程度存在相对较高的变异性，但因成本低、简单易行，能产生不同分级的DAI，且与人TBI高度类似，因而得到广泛应用[2]。

1.3控制性皮质撞击损伤(controlled cortical injury，CCI)模型 CCI模型使用气压、电磁等装置驱动刚性活塞撞击暴露的硬脑膜，模仿皮质损伤、急性硬膜下血肿、轴突损伤、脑震荡、血脑屏障功能障碍甚至昏迷等[9]。CCI在研究损伤程度较轻的TBI中具有较大优势，在啮齿类动物脑震荡模型中，轻微CCI后脑灌注及脑血流量降低，但无脑脊液漏；病理组织学研究证实，轻度CCI后，神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞Fluoro Jade染色阳性率增加，皮层神经元、树突棘及突触的数量减少[10]。CCI脑损伤程度与打击速度、变形深度有关，当撞击速度>4.3 m/s、脑组织变形>1 mm时可引起广泛性神经元损伤，且损伤能够扩散，造成急性皮质、海马、丘脑的变性，皮层下白质、内囊、脑干等部位可见DAI表现[11]。相对于其他TBI模型，CCI模型可对机械因素进行调节，如速度、时间、撞击深度，适用于TBI生物力学研究[12-13]。同自由落体撞击模型相比，CCI模型避免了撞击反弹引起二次伤害风险。对CCI模型进行调控可满足特定实验的需求，因而被广泛用于分析神经元坏死和神经缺陷的代谢、分子、遗传机制的研究，但其设备昂贵、复杂，实验精度要求高，操作较为复杂。

2NSCs治疗TBI

2.1NSCs的定义 NSCs是一类可生成神经组织或来源于神经系统，具有自我更新能力，可通过不对称细胞分裂产生除自我子代以外的其他类型的细胞。NSCs不仅存在于胚胎期的脑组织中，在发育成熟的脑组织也有NSCs的存在，其主要分布在前脑的室管膜下区和海马齿状回的颗粒细胞下层。Dash等[14]发现，TBI后啮齿类动物海马区颗粒细胞层神经细胞再生增加，但大部分神经再生形成了星形胶质细胞，说明自体NSCs在神经组织损伤后能进行自我代偿修复，但是能力有限。

2.2自体和异体NSCs移植自体NSCs经体外培养、扩增后移植避免了移植后免疫排斥反应。相对而言，自体移植的NSCs具有较高的存活率，但自体NSCs的提取是有创的，会加重损伤甚至直接导致死亡[15]。克隆技术的发展似乎带来了解决这一问题的曙光，但该技术复杂、耗时长、成本高，且存在医学伦理限制，因而目前难以广泛应用。目前异体NSCs移植的研究较多，但异体移植后存活率低，这可能与免疫排斥以及增殖分化受机体微环境影响有关。异体NSCs移植能改善运动功能，但是对认知功能的改善作用并不明显[16]。

2.3植入时间和部位的选择 目前关于最佳移植时间和移植部位尚无统一结论，还需要更多的研究加以证实。TBI后脑组织可发生水肿、神经元细胞死亡及炎症反应，尤其是TBI早期小胶质细胞的活化可产生细胞毒效应，其可发挥巨噬细胞样功能，并产生炎性介质和免疫调节因子。小胶质细胞激活后可通过多种方式对神经网络进行更改，包括促进神经元死亡，影响神经环路信息传递、神经修复性重组以及突触剥离[17]。急性期(伤后3 h~3 d)炎性介质、促炎因子、兴奋毒性神经递质以及自由基的大量释放可产生神经毒性和氧化应激反应，这些均可能影响植入NSCs的生长和存活[18]。Lee等[19]将NSCs直接植入到脑出血模型大鼠的病灶部分发现，NSCs具有免疫调节和抗炎作用，超急性期(伤后2 h)植入可减少早期神经元的凋亡、降低脑水肿的形成、减少炎性浸润；早期植入(伤后24 h)可减少肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和核因子κB的生成。虽然小胶质细胞的激活影响植入NSCs的增殖、分化、存活以及迁移，但相应的NSCs也会调节小胶质细胞的功能和活动，两者相互作用、相互影响[20]。Shear等[21]以CCI动物模型为基础，分别在伤后第2 、7、14 天将NSCs立体定向移植到受伤侧纹状体或对侧皮质区，在移植后第1周、2周、7周时对小鼠的运动能力进行评估，在移植后第5周对空间学习能力进行评估，在移植后第8周对NSCs的存活、移位、分化进行组织学检查，以观察最佳的移植条件。研究结果发现：①外伤后2~7 d是最优的移植时间窗；②移植时间并不影响短期的表型分化；③移植部位影响NSCs的表型和功效，移植到邻近损伤灶皮质区或纹状体的NSCs具有更高的存活率、更强的迁移能力，大鼠的运动功能也能得到更迅速的部分恢复；⑤NSCs的调控功能不因NSCs迁移和分化表型的差异而改变。

大鼠TBI后急性期，部分神经环路中的主神经元、γ-氨基丁酸(gamma-amino butyric acid，GABA)能中间神经元数量减少，同时小胶质细胞激活，反应性星形胶质细胞和促炎细胞因子出现，异常神经元发生或新生神经元异常迁移[22]。TBI急性期齿状回表达reelin蛋白的中间神经元数量减少，而reelin蛋白被认为与皮质的发育及形成密切相关[23]。TBI急性期NSCs移植干预调制了这些不利影响，NSCs分化形成的GABA能神经元和星形胶质细胞可分泌多种神经营养因子如脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-line derived neurotrophic factor，GDNF)、成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor-2，FGF-2)、胰岛素样生长因子1、血管内皮生长因子等[24]，其中BDNF、GNDF和FGF-2能抑制海马损伤后癫痫的发生。若TBI导致海马神经元受损，GABA能阻止海马神经元轴突内淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)蓄积。APP增多导致的轴突肿胀进而影响轴浆运输被认为是TBI后神经元变性发展为认知功能障碍的原因之一[25]。总之，TBI急性期NSCs移植在一定程度上能改善受损的记忆、认知和精神障碍，并抑制癫痫的发生或减轻发作的频率和强度[26]。

2.4TBI中NSCs神经修复的潜在机制 近年来，NSCs的特性及神经修复作用已被公认，但是NSCs移植治疗TBI的具体机制有待进一步研究。到目前为止，关于NSCs移植治疗TBI的修复机制有两大主流“学说”：①“细胞替换” 移植的NSCs进入受体后成活、分化后替换受损或凋亡的神经元并重建受体受损的突触回路；②“旁观者效应” 移植的外源性NSCs进入受体后分泌神经营养因子、抗炎物质、抗氧化应激分子等拯救受损的受体细胞，启动受体NSCs内源性修复机制，使受损区形态结构得以恢复[27]。最近Tajiri等[28]提出了“干细胞生物桥梁”的概念：移植的干细胞在宿主体内形成一个生物通路，这个通路富含基质金属蛋白酶，它将室管膜下区的内源性NSCs摆渡到受损伤的脑组织区域以完成修复。

3NSCs移植治疗TBI存在的问题

虽然大量动物实验证实，NSCs移植对TBI有一定的治疗作用，但其作用机制复杂，仍需进一步研究。未来的研究应着重于以下几个问题：①如何对植入的NSCs进行调控，使其有更高的存活率，并向损伤区迁移、发生定向分化以修复受损的神经；②探索最佳的植入手段、植入时间、植入部位、植入数量以及移植治疗持续的疗程；③移植后产生免疫排斥反应、致瘤性等。

4小结

总之，NSCs移植作为治疗TBI的新方法，能从细胞水平上对受损的神经进行修复和保护。随着对NSCs研究的进一步深入，相信不久的将来NSCs移植治疗定会翻开崭新的一页，实现从动物实验到临床治疗的转化，使其成为治疗TBI的重要方法之一。

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Neural Stem Cells Transplantation in Treatment of Traumatic Brain InjuryLIUJi-xing,HOUBo-ru,YANGWen-zhen,RENHai-jun.(DepartmentofNeurosurgery,theSecondHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730030,China)

Abstract：Neural stem cells (NSCs) is defined the cells having the ability of immortalization proliferation and multi-directional differentiation potential located in the nervous system.In animal models of traumatic brain injury(TBI),NSCs transplantation is affirmed as an efficient therapeutic method which can improve and protect neural function such as the motor,sensory and cognitive ability,which could also inhibit the neuroinflammation at early time and pathogenetic condition development to some degree.The application of NSCs in TBI has broad prospects despite the problems of complicated functioning mechanisms,sourcing,regulation of proliferation and differentiation,safety,neural circuits renewal and so on.

Key words：Traumatic brain injury； Neural stem cells； Animal models； Transplantation

收稿日期：2015-04-01修回日期：2015-06-30编辑：辛欣

基金项目：甘肃电信萃英科研基金(lzudxcy-2014-8)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.004

中图分类号：R651.1

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)24-4426-03