新型透明质酸改性的CS—g—PEI/pDNA的构建及介导转染软骨细胞的体外研究

陈明伟+范彬彬+卢华定

[摘要] 目的 探讨新型透明质酸改性的聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA（CS-g-PEI/pDNA）纳米粒作为治疗骨关节炎（OA）的可行性。 方法 通过复凝聚法制备成CP/pDNA纳米粒，然后通过巯基的原位交联与巯基化的透明质酸（HA-SH）形成交联网络，从而合成HA-CP/pDNA纳米粒；透射电镜观察纳米粒形貌，马尔文粒度分析仪分析其不同构成比（HA-SH∶CP）时的粒径、表面电位等；凝胶电泳阻滞实验检测CP/pDNA的结合力；CCK-8细胞毒性实验检测该基因载体的细胞毒性；以HA-CP/pDNA纳米粒、裸pDNA、CS/pDNA、CP/pDNA纳米粒、LipofectamineTM2000转染软骨细胞，荧光显微镜、流式细胞仪检测基因转染效率。 结果 ①HA-CP/pDNA纳米粒呈较均一的球形，并随HA-SH∶CP质量比的增加，粒径先减小后增大，表面电位电荷逐渐降低。②HA-CP/pDNA纳米粒对软骨细胞毒性远低于LipofectamineTM2000（P < 0.05）。③HA-CP/pDNA纳米粒对软骨细胞转染率较CP/pDNA、CS/pDNA纳米粒大大提高（P < 0.05）。④大量游离HA导致HA-CP/pDNA纳米粒对软骨细胞的转染效率下降。 结论 HA-CP/pDNA纳米粒具有更强的DNA保护能力，对软骨细胞毒性小，转染效率高，并且对软骨细胞具有一定的靶向性。

[关键词] 透明质酸；CP/pDNA纳米粒；基因治疗；软骨细胞

[中图分类号] R318.08 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（c）-0004-06

[Abstract] Objective To investigate the feasibility of hyaluronic acid modified CS-g-PEI/pDNA nanoparticles and mediated gene transfection against osteoarthritis. Methods CP was engaged with pEGFP into nanopartricles by using complex coaceration method and then covering the CP/pDNA with HA-SH， HA-SH forming disulfide cross-linked gene complex， and on the surface of the CP/pDNA form cross-linked network with HA， synthesis HA-CP/pDNA； the morphy of nanoparticle was obtained by TEM， the particle size and surface potential were measured by Malvern particle size analyzer； The pDNA binding ability with CP and the influence of HA-SH on CP were evaluated by gel retardation assay； the cytotoxicity of HA-CP/pDNA nanoparticles was evaluated by CCK-8 assays； HA-CP/pDNA nanoparticles， nake pDNA， CS/pDNA， CP/pDNA nanoparticles and lipofectamineTM2000 transfected chondrocytes， the transfection efficiency was measured by flurescence microscope， flow cytometry. Results ①TEM showed that the nanoparticles were well-formed spherical shapes with compact structure， and increased with HA-SH∶CP weight ratio increasing， nanoparticle sizes decreased firstly then increased， the surface potentials gradually decrease. ②The cytotoxicity of HA-CP/pDNA nanoparticles had lower cellular toxicity than LipofectamineTM2000 （P < 0.05）. ③The HA-CP/pDNA nanoparticles transfection efficiency for chondrocytes was highly improved compared to CS/pDNA， CP/pDNA nanoparticles （P < 0.05）. ④Free HA decrease HA-CP/pDNA nanoparticles transfection efficiency notably. Conclusion HA-CP/pDNA has lower cytotoxicity and higher transfection efficiency， and it has the ability of targeting chondrocytes.

[Key words] Hyaluronic acid； CS-g-PEI/pDNA； Gene therapy； Chondrocyte

在基因治療中，理想的基因载体应具有较高的转染率、良好的靶向性等安全性特点[1]。病毒载体靶向特异性差，存在高免疫原性、致癌性等缺陷[2-3]。而非病毒基因载体因其低免疫性、较高靶向性及材料可修饰性，成为当下研究热点[4-6]。聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA（CS-g-PEI/pDNA）纳米粒能有效保护质粒DNA免受核酸酶降解，对关节软骨细胞有较高的转染效率[7]；HA因其高度的黏弹性、可塑性、优良的生物相容性等特点，被广泛应用于临床包括骨关节炎（OA）的治疗。本研究创新性地将巯基化的透明质酸（HA-SH）与CS-g-PEI/pDNA纳米粒相结合形成透明质酸改性的CS-g-PEI/pDNA（HA-CP/pDNA）纳米粒。通过理化特征检测及体外基因转染软骨细胞实验等，探讨其作为治疗骨关节炎靶向基因载体的可行性，为开发出安全高效的治疗OA的新型靶向基因治疗药物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新西兰3周龄白兔3只，体重0.5～0.6 kg，均为雄性，购置于广东省医学实验动物中心（合格证号：SCXK 2008-0002）。

1.2 主要试剂及仪器

壳聚糖（CS，50 kD，脱乙酰度85%～90%）、聚乙烯亚胺（PEI，1.8 kD）、Ⅱ型胶原酶（Sigma-Aldrich，美国）；pEGFP、DH5α感受态细胞、LipofectamineTM2000、CCK-8（Invetrigen，美国）；高糖DMEM、PBS、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶/EDTA（Gibco，美国）；青霉素G钠、两性霉素B（广州杰特伟公司，中国）；HA（10 kD，山东正大福瑞达生化有限公司，中国）；去内毒素质粒大提试剂盒（Omega）；流式细胞仪（BD FACSCalibu）；磁共振仪（ARX400，Bruker，德国）；马尔文ZS90粒度仪（马尔文仪器公司，英国）；倒置荧光显微镜（Nikon-TE2000-U，日本）。

1.3 方法

1.3.1 pDNA准备 将pEGFP经E.coli DH5α细胞在含卡那霉素的LB培养基上进行增殖。利用Omega质粒大提试剂盒进行质粒的提取、纯化。所得质粒pEGFP经核酸蛋白分析仪检测纯度与浓度，-30℃保存备用。

1.3.2 HA-CP/pDNA纳米粒的制备 参照Jiang等[8]和Pezzoli等[9]的方法进行CP的合成，HA-SH的合成参考Jin等[10]和He等[11]的方法。合成后的样品溶于D2O/CD3COOD（11∶1），通过1HNMR检测，得到核磁谱图，核磁软件MestReNova进行分析。

将1 μg/μL CP按一定质量比与pDNA轻柔混合，静电吸附[12]作用制得CP/pDNA纳米粒溶液。将1 μg/μL HA-SH水溶液滴至CP/pDNA（pH = 5.5）中，纳米粒表面形成HA涂层，介质pH调至7.4，通过氧气中巯基的原位交联形成基因复合物组装体，即制得HA-CP/pDNA纳米粒。

1.3.3 HA-CP/pDNA纳米粒形貌特征检测及表面电荷测定 无水乙醇分散HA-CP/pDNA纳米粒溶液，滴于铜网放置30 min，真空干燥过夜，磷钨酸负染后透射电镜观察。马尔文ZS90粒度仪测量HA-CP/pDNA纳米粒粒径及表面Zeta电位。

1.3.4 凝胶电泳阻滞实验 取裸pDNA溶液和不同质量比的CP/pDNA纳米粒溶液（CP∶pDNA为1∶20、1∶8、1∶6、1∶4、1∶2、1∶1），进行1%琼脂糖凝胶电泳。配制不同质量比的HA-SH：CP/pDNA（1∶5、1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1）溶液并将其加入到CP/pDNA中观察HA-SH与CP/pDNA的浓缩能力，电泳并分析结果。

1.3.5 HA-CP/pDNA纳米粒的细胞毒性试验 细胞毒性试验采用CCK-8法进行测定[21]，计算细胞存活率。计算公式=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%，计算结果后对数据进行统计学分析。

1.3.6体外转染软骨细胞 重新制备CS/pDNA、CP/pDNA（CP：pDNA质量比为5∶1）、HA-SH/pDNA的纳米粒溶液，裸pDNA为阴性对照组，LipofectamineTM2000为阳性对照组。取第3代软骨细胞以1×105/孔接种到24孔板中，每孔预先加入500 μL完全培养基，培养24 h，移除培养基；PBS轻洗2遍，加入500 μL无FBS、双抗的高糖DMEM培养基培养30 min后除去培养基；将不同纳米粒溶液、裸pDNA以2 μg/孔pDNA加入500 μL不含FBS、双抗的高糖DMEM培养基中。LipofectamineTM2000转染则以每孔0.6 μg pDNA∶1.8 μL LipofectamineTM2000加入培养孔中。培养4 h后，更换完全培养基（500 μL/孔）培养48 h，倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。转染48 h后，0.25%的胰蛋白酶/EDTA消化3 min，1000 r/min 5 min，PBS重悬，流式细胞仪定量检测绿色荧光蛋白表达率。在转染HA-CP/pDNA纳米粒之前，细胞培养孔中加入过量HA，分别为HA-CP/pDNA纳米粒中HA-SH的10、20、40倍，流式细胞仪定量检测转染效率。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CP和HA-SH的核磁检验

图1所示，CS在化学位移δ = 3.0×10-6～4.1×10-6，PEI在化学位移δ = 2.1×10-6～3.5×10-6为其特征质子峰。图1a表明，CS和PEI成功进行了接枝反应，通过核磁计算接枝率为5.5%，图2表明1HNMR图谱中化学位移δ = 1.9×10-6处的信号峰为HA乙酰氨基甲基上的氢原子，化学位移δ = 2.5×10-6～2.7×10-6處为HA-SH中半胱胺亚甲基上的质子峰，表明HA巯基化成功[10，13]。采用Ellman试剂法[14]测定HA-SH中巯基的接枝率约为4.2%。

2.2 HA-CP/pDNA纳米粒形态特征及表面电荷

图3所示，HA-SH∶CP质量比为10∶1时经透射电镜下观察，HA-CP/pDNA纳米粒形态表面光滑的球形，粒径在100～300 nm之间，分散度良好。纳米粒的粒径随HA-SH∶CP质量比增加先减小后增大，Zeta电位逐渐减小（图4）。HA-SH∶CP质量比为5∶1时，粒径最小为（255.7±11.4）nm。HA-SH∶CP质量比大于5∶1后，电位越小，纳米粒经越大，甚至在质量比为20∶1时，纳米粒径达到700 nm以上。

2.3 凝胶电泳阻滞实验结果

由图5a可知，裸pDNA跑出加样孔，而CP/pDNA纳米粒随着CP与pDNA质量比的增高后，跑出的条带越来越弱，在CP∶pDNA为1∶2时，能阻滞pDNA向阳极移动，使pDNA条带消失。加入HA-SH后（CP∶pDNA为1∶4），图5b可观察到随着加入HA-SH量的增加，原有跑出的pDNA条带逐渐消失。

2.4 细胞毒性实验

HA-CP/pDNA纳米粒与CP/pDNA纳米粒对软骨细胞活力差异无统计学意义（P > 0.05）。在针对软骨细胞的细胞毒性实验中，实验组的HA-CP/pDNA纳米粒和的CP/pDNA纳米粒浓度增至40 μg/mL时细胞的存活率也在90%以上，显著高于对照组（5 μg/mL的LipofectamineTM2000），差异有高度统计学意义（P < 0.01）。HA-CP/pDNA纳米粒，软骨对细胞毒性均显著低于LipofectamineTM2000（P < 0.01），后者的细胞存活率低于60%。见图6。

2.5 体外基因转染实验结果

2.5.1 不同载体体外转染软骨细胞和滑膜细胞的比较 HA-CP/pDNA纳米粒组与LipofectamineTM2000组荧光强度最强，CP/pDNA和CS/pDNA纳米粒组有较多细胞表达绿色荧光蛋白，裸pDNA组只有极个别细胞表达弱的绿色荧光，四组之间软骨细胞的转染效率差异有统计学意义（P < 0.05）。见图7。流式细胞仪检测HA-CP/pDNA、CP/pDNA、CS/pDNA、裸pDNA和LipofectamineTM2000组48 h转染率分别为（26.46±1.76）%，（16.34±1.26）%，（6.78±0.62）%，（0.32±0.06）%和（28.26±2.07）%（n = 6，P < 0.05）（图8，封三）。HA-CP/pDNA纳米粒组与裸pDNA、CP/pDNA纳米粒组、CS/pDNA纳米粒组在转染率差异有高度统计学意义（P < 0.01），而与LipofectamineTM2000组差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.5.2 HA对HA-CP/pDNA转染软骨细胞效率的影响 随着转染前加入HA量的增加，HA-CP/pDNA对软骨细胞的转染效率逐渐降低，当50倍于HA-CP/pDNA中HA-SH的量时，转染效率降低显著（P < 0.05）。见图9。

3 讨论

基因治疗中理想的基因载体应具有生物相容性好、毒性低、转染效率高等特点[15-16]。软骨细胞表面存在的CD44膜蛋白受体是最常见的透明质酸受体[17-18]。本实验通过HA与CD44受体特异性结合，实现靶向基因转染，提高CP对软骨细胞的转染效率。本实验将巯基化的HA通过氧气中巯基的原位交联[11]，在CP/DNA表面形成带HA交联网络，可促使聚合物更稳定，通过HA-CD44作用达到对软骨细胞的靶向基因转染。核磁结果证明了CP与HA-SH的合成是成功的。随着HA-SH∶CP质量比的增加纳米粒的粒径先减小后增大，Zeta电位逐渐减小。粒径先减小后增大主要是因为，在一定范围内HA-SH∶CP质量比≤10∶1时，加入的HA-SH通过氧气中巯基的原位交联，在CP/pDNA纳米粒表面形成HA交联网络，对纳米粒进一步压缩，使得聚合物更加稳定，粒径更小；粒径增大是由于随着HA-SH加入量的增加，过量的HA-SH使得纳米粒表面电荷越来越小；当HA-SH∶CP质量比≥20∶1时，纳米粒的Zeta电位趋于中性，而纳米粒在溶液中维持形态首先要聚合物结合紧密，其次需要足够的同性电荷斥力来保持纳米粒之间的距离，当电荷逐渐减小时，纳米粒表面电荷之间静电作用力越来越弱，使得纳米粒溶液极不稳定，纳米粒相互聚集[19]。

在凝胶阻滞实验中，随着CP∶pDNA质量比的提高，凝胶电泳跑出的pDNA的条带越来越弱，说明CP：pDNA聚合物结合pDNA的能力越来强，而游离出来的pDNA也越来越少。当质量比为1∶2时，已无明显的条带跑出，说明此时聚合物完全包裹pDNA。在CP/pDNA（1：4）的复合物中加入HA-SH可看到，随着HA-SH的增加，原有跑出的条带逐渐减弱，当HA-SH∶CP/pDNA质量比为10∶1时，已无条带跑出，这也证实了HA-SH对CP/pDNA纳米粒具有进一步压缩作用，使纳米粒更加稳定。CCK-8细胞毒性实验检测显示，即使HA-CP/pDNA纳米粒浓度达到至40 μg/mL，细胞的存活率也能达到90%以上，其细胞毒性远小于LipofectamineTM2000。可能因为HA具有良好的生物相容性，且合成的CP中引入的是小分子的PEI（1.8 kD），所带表面电荷较低，CP细胞毒性较小。因此HA-CP/pDNA纳米粒可作为一种安全的基因载体应用于OA的基因治疗。

由体外基因转染实验结果可知，HA-CP/pDNA纳米粒转染效率明显高于CP/pDNA、CS/pDNA，主要因为：①纳米粒载体进入细胞方式的多样化。在HA-SH对CP/pDNA进行修饰后，形成的纳米粒一方面通过HA与软骨细胞表面的CD44受体特异性结合，利用受体介导的细胞內吞方式进入细胞；另一方面，在HA-SH∶CP质量比为10∶1时，纳米粒表面仍带有正电荷，可与胞膜上有带负电荷的脂肪酸结合，使得纳米粒沉积于细胞表面从而被内吞进入细胞。②HA与CD44的相互作用引发细胞内的信号传导促进转染效率的提高[20]。③HA与CP/pDNA的结合方式使得HA-CP/pDNA纳米粒具有较高稳定性。HA-CP/pDNA纳米粒进入细胞后，在GSH作用下，二硫键还原成SH，纳米粒表面交联网络破坏，HA-CP/pDNA解离，釋放DNA，细胞分裂时，DNA有更多的机会进入细胞核表达目的基因。④HA可作为一种基因转录活化剂[21]，提高HA-CP/pDNA纳米粒的基因转染效率。在转染之前加入过量的HA，HA-CP/pDNA的转染效率明显降低[22]，这是因为游离的HA与软骨细胞表面的受体CD44结合[15，23]，竞争性的抑制了HA-CP/pDNA中HA与CD44的结合，进一步说明了HA-CP/pDNA纳米粒对软骨细胞的靶向作用。转染早期HA-CP/pDNA的转染效率低下，而细胞转染48 h后，转染效率明显升高，这是因为HA-CP/pDNA纳米粒经细胞膜內吞作用进入细胞后，需要在GSH的作用下首先降解HA-SH在CP/pDNA表面形成的二硫键网络后才能逐渐释放出所携带的DNA，因其缓控释性能，大大增强了其在体内关节疾病中的应用潜能。

实验通过复凝聚法构建了CP/pDNA纳米粒，再在其表面覆盖HA-SH，通过氧气中巯基的原位交联形成基因复合物组装体，制得HA-CP/pDNA纳米粒，并对其理化性质及对pDNA的保护能力进行检测；HA-CP/pDNA纳米粒与软骨细胞相容性良好，在有效的转染浓度范围内，CCK-8试验表明其毒性远远低于LipofectamineTM2000，安全性可靠。HA-CP/pDNA纳米粒对软骨细胞的转染率较CS/pDNA、CP/pDNA高，与LipofectamineTM2000相当。HA-CP/pDNA纳米粒对软骨细胞具有一定的靶向性，随着配体HA的引入，能大幅提高CP、CS载体对关节软骨细胞的转染效率，同时减少毒副作用，因此HA-CP/pDNA纳米粒可作为治疗OA等关节疾病的一种非病毒基因载体。本实验虽然证实了HA-CP/pDNA纳米粒具有一定的靶向性并可提高软骨细胞体外基因转染的效率。但此研究尚停留在细胞分子水平，对于HA-CP/pDNA纳米粒在体内的体内的转染效果及有无不良反应，尚待进一步研究。

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