调节性T细胞在冠心病与牙周炎相互关系中的作用

丁畅，黄进，陆治平，王倩

• 论著 •

调节性T细胞在冠心病与牙周炎相互关系中的作用

丁畅，黄进，陆治平，王倩

目的探讨调节性T细胞在牙周炎促进冠心病进展中所起的作用。方法将90例患者依据冠状动脉造影结果及牙周炎Armitage诊断标准分为：胸痛综合征组（CPS组）、冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）组（CHD组）和冠心病合并牙周炎组（CHD-P组）；再将CHD-P组分为冠心病合并轻、中度牙周炎组（CHD-P1组）、冠心病合并重度牙周炎组（CHD-P2组）。采用流式细胞仪分析CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占T淋巴细胞的比例。结果Gensini评分CHD-P2组（65.86±39.94）较CHD-P1组（31.23±33.53）和CHD组（13.09±7.59）明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。CHD-P1组较CHD组Gensini评分明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T在CHD-P组为[（1.93±0.46）%]较CHD组[（2.32±0.72）%] 和CPS组 [（2.54±0.95）%] 明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论牙周炎使冠心病患者的调节性T细胞数量进一步下降，调节性T细胞与牙周炎促进冠心病的进展密切相关。

冠心病；牙周炎；调节性T细胞；动脉粥样硬化

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是一种多因素疾病，其准确的发病机制还不完全清楚，吸烟、高血压、高血脂、肥胖和糖尿病等是传统的冠心病的危险因素。然而，近年来许多研究发现炎症因子与冠心病密切相关，其中牙周炎可能是诱导冠心病发生的又一危险因素[1]。

牙周炎可以增加系统炎症因子的水平，进而诱发或加剧血管壁的动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）病理进程[2]。T淋巴细胞介导的细胞免疫参与了AS的炎症反应过程，在促进斑块进展和保持斑块稳定中都起一定作用[3,4]。调节性T细胞（Treg）的数量减少或者功能降低都会导致自身免疫失调，这可能是T淋巴细胞参与AS进展的重要作用机制[5]。本研究希望通过检测患者的CD4+CD25+FoxP3+Treg含量，分析牙周炎对冠心病患者调节性T细胞数量的影响，为进一步阐明牙周炎与冠心病的关系提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象与分组

纳入2012年1月至2013年10月于南京市胸科医院心血管内科首诊疑似冠心病的住院患者90例，其中男52例，女38例，年龄（62.21±9.62）岁。根据冠状动脉造影结果和牙周炎Armitage诊断标准将患者分为三组:胸痛综合征组（CPS组）26例，男15例，女11例，年龄（58.6±9.0）岁，CPS定义为有胸痛但不伴有心电图的改变和冠状动脉狭窄及痉挛、同时冠状动脉造影结果正常；冠心病组（CHD组）22例，男13例，女9例，年龄（64.84±10.30）岁；冠心病合并牙周炎组（CHD-P组）42例，男24，女18例，年龄（63.08±9.17）岁。再根据牙周炎的严重程度将冠心病合并牙周炎组（CHD-P组）分为①冠心病合并轻中度牙周炎组（CHD-P1组）20例；②冠心病合并重度牙周炎组（CHD-P2组）22例。

排除标准：曾经予以冠心病规范化治疗的患者；合并严重的肝肾功能不全者；周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病者；恶性肿瘤患者；糖尿病和风湿性疾病患者。此外，合并感染性疾病如败血症、严重的上呼吸道感染、肺部或肝胆道感染等、高热及应用炎症抑制药物如非甾体类抗炎药、类固醇及鸦片类药物等均予以剔除。研究经伦理委员会批准，并获取研究对象的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 冠状动脉造影及冠状动脉狭窄评分采用Judkin’s技术进行冠状动脉造影，依据哈里森内科学诊断标准：前降支（LAD）、回旋支（LCX）或右冠脉（RCA）及其分支中、或左主干（LM）存在＞50%直径的固定性狭窄或阻塞性病变。冠状动脉狭窄程度的评分标准采用Gensini（GS）评分法。

1.2.2 牙周炎的诊断标准由牙周科医生测量并记录每例受检者缺失牙情况、全口牙周袋深度（PD）、临床附着丧失（CAL）、探诊出血指数（BOP）及牙齿松动度（TM），参照Armitage 诊断标准将牙周炎分为：轻度（平均CAL0.6～1.5 mm ，邻面部位CAL＜3 mm，缺失牙≤3颗）、中度（平均CAL 1.6～2.4 mm，口内至少3个区或至少6颗牙齿但不超过8个部位邻面CAL≥3 mm ，缺失牙≤5颗）、重度（平均CAL≥2.5 mm，口内3个区有1个或多个部位邻面CAL≥5 mm，缺失牙≤14颗），以上拔出第三磨牙、正畸拔牙、外伤导致牙脱落及先天缺牙均除外。

1.2.3 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达的检测静脉血1 ml用PBS 1:1稀释，缓慢加入等量的人淋巴细胞分离液中，2200 rpm水平离心20 min，取单个核细胞层，加入PBS洗涤，1500 rpm水平离心10 min，去上清液；取A（同型对照管）、B（检测管）两管，每管加约5.0×105个细胞，以CD4/CD25混合抗体4℃避光孵育30 min，洗涤后加入1 ml固定/破膜工作液，4℃避光孵育60 min，A管加入IgG抗体，B管加入Foxp3抗体，4℃避光孵育30 min，洗涤后加适量流式缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测。试剂购自美国BD公司。

1.3 统计学处理检测结果以均数±标准差（± s）表示，数据用SPSS 13.0 软件进行分析，多组均数间采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 —般资料CPS组与CHD组的年龄、总胆固醇（TC）有差异，差异有统计学意义（P＜0.05）。CPS组、CHD组和CHD-P组，三组在性别、吸烟率、血压、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）等差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

年龄和TC均系CHD已知危险因素，本调查研究使用方差分析（One-way ANOVA）结果提示：在分析牙周炎与CHD关系时应将它们作为混杂因素排除。用多因素Logistic回归分析，统计学上可排除年龄（OR值2.815，P值0.093）和TC（OR值2.418，P值0.120）对CHD的影响（P＞0.05）。

2.2 冠心病患者冠状动脉狭窄程度G S（Gensini）评分的比较排除CPS组仅选取CHD组及CHD-P组患者，进行冠状动脉粥样狭窄程度的比较。结果CHD组的GS评分为（13.09 ±7.59），CHD-P1组的GS评分为（31.23± 33.53），CHD-P2组的GS评分为（65.86± 39.94）。GS评分CHD-P2组较CHD-P1组和CHD组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。GS评分CHD-P1组较CHD组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 CPS组、CHD组、CHD-P组一般资料比较

2.3 各组患者CD4+CD25+T细胞占单核细胞（PBMC）的比率（图1）CD4+CD25+T/PBMC在CHD-P组为[（7.92±2.96）%]、CHD组为[（7.64 ±3.05）%]、CPS组为[（8.50±3.27）%]，经过统计学分析，显示CD4+CD25+T/PBMC在CHD-P组、CHD组、CPS组间无明显差异（P＞0.05）（表2）。

2.4 各组患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达的分析（图2）CD4+CD25+Foxp3+Treg/ CD4+T在CHD-P组中为 [（1.93±0.46）%] 较CHD组 [（2.32±0.72）%] 和CPS组 [（2.54± 0.95）%] 明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；CHD组CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T较CPS组降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

图1 CPS组、CHD组、CHD-P组患者外周血CD4+CD25+T细胞在PBMC中的比率

图2 CPS组、CHD组、CHD-P组患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T细胞的比率

表2 CHD-P、CHD、CPS组CD4+CD25+T、CD4+CD25+Foxp3+Treg的比较

3 讨论

冠心病是目前威胁人类生命健康的首要疾病之一。传统的观点认为冠心病的主要病因是冠状动脉粥样硬化，但迄今为止AS的原因尚不完全清楚，可能是多种因素综合作用的结果，炎症反应可能是导致冠心病进展的危险因素之一。1999年Ross明确提出“动脉粥样硬化是一种炎症性疾病”，认为AS并非单纯是脂质沉积，机体的炎症反应是突出的表现，它在AS斑块的形成中起着重要作用。

近年来多项研究表明，牙周炎与心血管疾病的发生具有密切联系。2001年，Beck等[6]评估了不同年龄段的921名无心血管病人群，经过18年随访发现牙槽骨吸收与心血管病患病之间存在相关性，在校正了年龄、吸烟、血清胆固醇水平、血压等因素后，发现牙周状况是预测心血管病风险的重要指标。Schillinger和Holmlund等[7,8]的研究也显示牙周炎症程度，特别是牙周炎引起缺失牙数目，与冠脉狭窄程度相关。Bahekar等[9]对五项牙周病与心血管病关系的前瞻性研究进行了Meta分析，结果显示牙周炎患者患心血管疾病的风险是牙周健康者的1.4倍，牙数少于十颗患者患病风险增加1.24倍。本研究结果显示CHD-P2组较CHD组和CHD-P1组GS评分明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；CHD-P1组较CHD组GS评分明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。本研究结果提示牙周炎的严重程度与冠状动脉的狭窄程度呈正比，牙周炎可能促进了冠状动脉粥样硬化的进展。

冠心病与牙周炎的发病风险存在着相关性，其可能的机制主要有以下几点：①牙周炎患者常有一些不良的生活习惯（如吸烟、肥胖、糖尿病、缺乏运动、饮食习惯的改变等），这些习惯也是诱发AS的危险因素。②牙周致病菌或其产物能进入患者的血液循环，并直接入侵患者的心血管内皮细胞和平滑肌细胞，引起血管内皮损伤，促进AS形成。③牙周炎患者牙周组织的局部会出现前列腺素、白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子及C反应蛋白（CRP）等炎症介质的大量表达，从而引发血小板的聚集和黏附，促进脂质细胞形成和血管内膜胆固醇沉积，加速血管平滑肌肥大，导致管壁增厚，促进AS的形成[2]。

牙周炎多数是牙龈卟啉单胞菌感染引起的，牙龈卟啉单胞菌感染诱导出T淋巴细胞免疫应答反应从而促进了AS。Treg是一批具有免疫抑制功能的T细胞，分泌免疫抑制因子白细胞介素-10和转化生长因子-β1等，以调节自身T细胞反应为主要功能，Treg可能使冠状动脉粥样硬化斑块更趋于稳定[10]。CD4+CD25+Foxp3+Treg为Treg中最重要的一类细胞，约占人和小鼠外周血CD4+T细胞的5%～10%，表达转录因子Foxp3是其特征性的标志。多种功能分子参与了Treg的免疫抑制功能，但控制其功能的核心是Foxp3。Treg数目的决定环节是其分化过程，实质上就是Foxp3被诱导表达的过程。2009年，Wiqren等[11]利用含铝佐剂疫苗免疫ApoE-/-小鼠，结果发现小鼠AS斑块面积减小且病变严重程度减轻，同时小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg数目增高，提示Treg激活可抑制AS形成。2013年，Roland等[12]利用白喉毒素注射获得Foxp3选择性缺失的小鼠，将Foxp3缺失小鼠骨髓移植至Ldlr-/-小鼠，结果显示Foxp3定向缺失后AS斑块明显比对照组增大，血浆TC和TG水平也明显增高，由此直接证明了Foxp3+Treg可通过调节脂蛋白代谢抑制AS。

本研究分析显示CD4+CD25+T/PBMC在CHD-P组、CHD组、CPS组间无明显差异，提示尚未分化成调节性T细胞的CD4+CD25+T细胞在三组患者体内的分布基本相同。实验又进一步分析了三组患者CD4+CD25+FoxP3+Treg占CD4+T细胞的比率，发现CHD-P组较CHD组和CPS组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；CHD组虽较CPS组降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。我们推测CHD组、CPS组间无明显差异，可能是由于CHD组患者的炎症反应相对比较轻微，或者CHD组样本量偏小所致。CD4+CD25+FoxP3+Treg/CD4+T在单纯冠心病、冠心病合并牙周病的患者中均是下降的，而且冠心病合并牙周病患者比单纯冠心病患者下降更加明显，提示牙周炎使冠心病患者的调节性T细胞数量进一步下降，调节性T细胞与牙周炎促进冠心病的进展密切相关。

综上所述，牙周炎可能通过被感染的牙周组织释放炎症介质、诱导内皮细胞功能障碍等作用促进冠状动脉粥样硬化的进展[13]。在上述炎症反应过程中，以CD4+CD25+Foxp3+Treg为代表的调节性T细胞在T淋巴细胞参与的动脉粥样硬化过程中起着关键作用。牙周炎引起冠心病患者调节性T细胞数量的进一步降低，打破了机体维持外周自身免疫应答的稳态，促进了冠状动脉粥样硬化的活化和进展。因此，调节性T细胞与牙周炎促进冠心病进展的作用密切相关，本研究为冠心病的诊断和治疗提供了新的思路。

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Role of regulatory T cell in relationship between coronary heart disease and periodontitis

DING Chang*, HUANG Jin, LU Zhi-ping, WANG Qian.*Department of Cardiology, Chest Hospital of Nanjing City, Nanjing 210029, China.

HUANG Jin, E-mail: huangjin6310@sina.com

ObjectiveTo investigate the role of regulatory T cells in progress of coronary heart disease (CHD) promoted by periodontitis.MethodsCHD patients (n=90) were divided, according to outcomes of coronary angiography (CAG) and Armitage diagnostic criteria of periodontitis, into chest pain syndrome group (CPS group, CHD group and CHD combining periodontitis group (CHD-P group), and then CHD-P group was further divided into CHD-P1 group (CHD combining mild-moderate periodontitis) and CHD-P2 group (CHD combining severe periodontitis). The proportion of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in regulatory T cells was analyzed by using flow cytometry.ResultsGensini scores increased significantly in CHD-P2 group (65.86±39.94) compared with CHD-P1 group (31.23±33.53) and CHD group (13.09±7.59, P＜0.05). Gensini scores increased significantly in CHD-P1 group compared with CHD group (P＜0.05). CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T decreased in CHD-P group [(1.93±0.46)%] compared with CHD group [(2.32±0.72)%] and CPS group [(2.54±0.95)%, P＜0.05].ConclusionThe quantity of regulatory T cells can be reduced further by periodontitis, so regulatory T cells is closely correlated to progress of CHD promoted by periodontitis.

Coronary heart disease; Periodontitis; Regulatory T cells; Atherosclerosis

R541.4

A

1674-4055(2015)03-0309-04

2015-01-04）

（责任编辑：张灵）

江苏省卫生厅医学科研项目(H201243)

210029 南京,南京市胸科医院心血管内科

黄进,E-mail:huangjin6310@sina.com

10.3969/j.1674-4055.2015.03.06