藤黄酸诱导肺癌细胞H1975凋亡的机制研究

2015-02-05何蕾王宝辉吕望泮辉胡坚

浙江医学 2015年13期

何蕾王宝辉吕望泮辉胡坚

何蕾王宝辉吕望泮辉胡坚

目的研究藤黄酸（GA）诱导人肺癌细胞H1975凋亡的分子机制，探讨氧自由基（ROS）和JNK信号通路在GA杀伤肺癌细胞中的作用。方法以人肺癌细胞H1975为研究对象，MTT法测定GA抑制细胞增殖的作用，Annexin V/PI双染法测定细胞凋亡率，DCFH-DA法测定ROS含量，JC-1探针染色分析线粒体膜电位（MMP），Western b lot检测JNK信号通路的激活和线粒体凋亡途径相关蛋白表达的变化。结果GA呈剂量依赖性抑制H1975细胞的增殖，各实验组细胞存活率与空白对照组比较，均有统计学差异（P＜0．05或0．01）。1、2．5和5μmol/LGA作用24h后，细胞凋亡率分别为25．2%、51．8%和75．1%，剪切型凋亡相关蛋白c leaved caspase-9、c leaved caspase-3和c leaved PARP的表达随GA浓度增高而显著增加，与空白对照组比较，均有统计学差异（P＜0．05或0．01）。GA作用2h后H1975细胞ROS含量显著升高，磷酸化JNK（p-JNK）表达上调（P＜0．05或0．01）。GA作用16h后各实验组细胞MMP均明显降低（均P＜0．05）。GA作用24h后实验组细胞线粒体凋亡途径相关蛋白Bax、Bak、Bik表达增加，而抗凋亡蛋白Bc l-2表达与空白对照组相比明显下降（P＜0．05或0．01）。结论GA具有诱导H1975细胞凋亡的作用，其可能机制是上调细胞内ROS含量，激活JNK信号通路，进而引起MMP降低和线粒体凋亡途径激活。

藤黄酸肺癌H1975细胞活性氧自由基 JNK信号通路凋亡

目前，我国肺癌的发病率和病死率居恶性肿瘤第1位[1]。近30年来肺癌的手术治疗、放化疗、新辅助治疗等取得了重大进展，但总体治疗效果仍不理想，ⅢA、ⅢB、Ⅳ期肺癌患者的5年生存率仍只有19.0%、7.0%和2.0%[2]。因此，寻找高效低毒的新型抗肺癌药物对于提高中晚期患者的生存率具有重要意义。中药藤黄取自藤黄科植物藤黄树（Garcinia hanburyi Hook.F.）分泌的干燥树脂，性寒，味酸、辛、涩，主治痈疽肿毒，顽癣恶疮[3]。藤黄酸（GA）是中药藤黄的主要活性成份，具有广谱抗肿瘤活性，能够有效抑制肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤细胞的增殖，且未对机体造血细胞的功能造成影响[4-6]，但GA抑制肺癌细胞增殖的分子机制尚未完全阐明。本研究以人肺癌细胞H1975为对象，观察GA对肿瘤细胞增殖的抑制作用，并探讨GA诱导细胞凋亡的分子机制。

1 材料和方法

1.1 药物和细胞株藤黄酸（C38H44O8，分子量628.76Da）购自成都曼思特生物科技有限公司，以二甲基亚砜（DMSO）配成50mmol/L的母液，-20℃保存，应用时以完全培养基稀释至目标浓度。人肺癌细胞株H1975购自中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂及仪器 MTT、DCFH-DA购自美国Sigma公司，Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit和MitoScreen（JC-1）Kit购自美国BD公司。兔抗人p-JNK、JNK、Bax、Bak、Bik、Bcl-2、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP、β-actin多克隆抗体及HRP标记的羊抗兔IgG抗体均购于美国Cell Signaling Technology公司。ECL化学发光试剂购自美国Thermo公司。iMark酶标仪、蛋白电泳及转印装置、凝胶成像系统均为美国Bio-Rad公司产品，流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养将H1975细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。

1.3.2 MTT法检测GA对H1975细胞增殖的影响H1975细胞按5.0×103个/孔接种于96孔板，细胞贴壁后弃去上清液，各实验组分别加入100μl含0.5、1、2.5和5μmol/L GA的完全培养基，每组设3个平行孔，空白对照组加入等体积的完全培养基。药物作用24h后，以MTT法分析GA对H1975细胞增殖的影响，酶标仪测定各孔490nm处A值，细胞存活率（%）=实验组平均A值/空白对照组平均A值×100%，实验重复3次。

1.3.3 流式细胞术检测GA对细胞凋亡率的影响 H1975细胞按3×105个/孔接种于6孔板。细胞贴壁后，实验组分别加入GA浓度为1、2.5和5μmol/L的含药培养基，空白对照组加入等体积的完全培养基，药物作用24h后收集各组细胞。洗涤、重悬细胞后取100μl细胞悬液加入10μl Annexin V-FITC标记液和10μl PI，混匀，室温避光孵育15min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.4 DCFH-DA法测定细胞内ROS含量细胞培养同上述，待细胞贴壁后，PBS洗涤2次，每孔加入1ml RPMI1640培养基稀释的DCFH-DA（终浓度为10μmol/L），避光孵育30min。PBS洗涤2次，分别加入GA浓度为1、2.5和5μmol/L的含药培养基和等体积的完全培养基。药物作用2h后收集各组细胞，流式细胞仪在激发波长488nm，发射波长525nm下检测细胞平均荧光强度，分析细胞内ROS含量。

1.3.5 JC-1探针分析GA对细胞线粒体膜电位（MMP）的影响细胞培养同上述，待细胞贴壁后，PBS洗涤2次，分别加入GA浓度为1、2.5和5μmol/L的含药培养基和等体积的完全培养基。继续培养16h，收集各组细胞，加入JC-1探针室温避光孵育15min，洗涤2次，以488nm为激发波长，流式细胞仪检测MMP的改变。

1.3.6 Western blot检测JNK通路活性和凋亡相关蛋白的表达细胞培养及药物处理同上述。抽提GA作用2h和24h的各组细胞总蛋白，其中GA作用2h收集的蛋白检测p-JNK、JNK，作用24h收集的蛋白检测Bax、Bak、Bik、Bcl-2、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP，以β-actin作为内参照。上样检测，化学发光试剂显色，胶片贴近曝光，显影、定影后用凝胶成像系统扫描分析。

1.4 统计学处理采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以表示，多组样本均数比较用单因素方差分析，两组间比较用t检验。

2 结果

2.1 GA抑制H1975细胞增殖 MTT法检测结果表明GA具有抑制H1975细胞增殖的作用，并呈剂量依赖性。0.5、1、2.5和5μmol/L的GA作用后各实验组细胞存活率分别为（91.8±5.1）%、（63.7±3.8）%、（31.5±4.8）%和（10.6±2.7）%，除0.5μmol/L组外，其余3组与空白对照组相比均有统计学差异（P＜0.05或0.01）。GA作用24h，对H1975细胞增殖抑制的IC50为1.6μmol/L。

2.2 GA诱导H1975细胞凋亡 Annexin V-FITC/PI双染法结果提示，1、2.5和5μmol/L GA作用24h，H1975细胞早期凋亡率分别为25.2%、51.8%和75.1%，均高于空白对照组的早期凋亡率4.9%（均P＜0.05），见图1。

图1 GA对H1975细胞凋亡的影响（A：空白对照组；B：GA 1μmol/L；C：GA 2.5μmol/L；D：GA 5μmol/L）

进一步采用Western blot法检测GA作用24h后H1975细胞内凋亡相关蛋白的表达，各实验组细胞内剪切型凋亡相关蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP表达水平与空白对照组相比均显著上调（P＜0.05或0.01），见图2。

图2 GA对H1975细胞内凋亡相关蛋白表达的影响

2.3 GA对H1975细胞内ROS含量的影响与空白对照组相比，1、2.5和5μmol/L的GA作用2h后，细胞内ROS含量均明显增加（均P＜0.05），且ROS含量随GA浓度的增高而上升，表明GA以剂量依赖方式增加H1975细胞内ROS的含量，见图3。

图3 GA对H1975细胞内ROS含量的影响（A：空白对照组；B：GA 1μmol/L；C：GA 2.5μmol/L；D：GA 5μmol/L）

2.4 GA对H1975细胞内JNK信号通路相关蛋白表达的影响 Western blot结果提示，GA作用2h后H1975细胞内p-JNK的表达水平随药物浓度增高而显著上升，与空白对照组比较均有统计学差异（P＜0.05或0.01），但不同浓度GA作用后各实验组间的p-JNK表达水平无统计学差异（P＞0.05），见图4。

图4 GA对H1975细胞内JNK信号通路相关蛋白表达的影响

2.5 GA对H1975细胞MMP的影响 GA作用16h后，H1975细胞MMP较空白对照组明显降低，均有统计学差异（均P＜0.05），且不同浓度GA作用后各实验组细胞MMP降低趋势呈剂量依赖关系，见图5。

2.6 GA对H1975细胞线粒体凋亡途径相关蛋白表达的影响进一步检测GA作用24h后线粒体凋亡途径相关蛋白Bax、Bak、Bik和Bcl-2表达的变化，发现JNK下游促凋亡靶基因Bax、Bak、Bik的蛋白表达随GA浓度增加而增高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达却呈下降趋势（P＜0.05或0.01），见图6。

3 讨论

GA是中药藤黄的主要活性成份，作为一种多靶点抗肿瘤药物，能通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡和分化、抗肿瘤细胞转移等多种途径发挥抗肿瘤作用[7-8]。张洪明等[9]报道GA对人肺癌细胞SPC-A-1的增殖具有显著的抑制作用，其分子机制与上调促凋亡蛋白p53的表达，激活caspase-9、caspase-10，启动凋亡级联反应有关。但对与细胞增殖、凋亡密切相关的ROS-JNK信号通路在GA诱导肺癌细胞凋亡中的作用尚无研究报道，本研究以人肺癌细胞H1975为研究对象，通过体外抗肿瘤活性评价及相关机制研究，证实GA可通过上调细胞内ROS含量，激活JNK信号通路，进而引起MMP降低和线粒体凋亡途径激活，最终诱导肺癌细胞凋亡。

图5 GA对H1975细胞MMP的影响（A：空白对照组；B：GA 1μmol/L；C：GA 2.5μmol/L；D：GA 5μmol/L）

图6 GA对H1975细胞线粒体凋亡途径相关蛋白表达的影响

细胞内源性ROS含量增加被认为是激活JNK的重要诱因[10]。Wang等[11]报道GA具有上调卵巢癌细胞株SKOV3内源性ROS含量的作用，本研究也证实GA能够上调肺癌细胞ROS含量。进一步检测下游应激活化蛋白激酶JNK的磷酸化水平，证实GA具有激活JNK的作用。ROS可通过促进丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）家族中的凋亡调节信号激酶1（ASK1）的磷酸化，进而激活JNK[12]；还可通过促进谷胱甘肽硫转移酶（GST）寡聚化，导致GST/JNK复合体解离从而活化JNK[13]。GA上调内源性ROS含量通过何种途径激活JNK信号通路，以及GA激活JNK是否仅依赖于ROS的上调有待进一步研究。

JNK信号通路的活化可导致细胞凋亡[14]，本研究亦发现H1975细胞凋亡率在GA干预后显著上升。活化的JNK可通过转录依赖的方式调节靶基因表达而诱导细胞凋亡[15]，本研究证实GA干预后JNK下游促凋亡靶基因Bax、含有BH3结构域家族的Bak、Bik蛋白表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降。正常细胞中，Bcl-2与Bax和线粒体膜本体蛋白Bak以异源二聚体形式存在，阻止Bax和Bak的寡聚化，从而维持MMP，抑制细胞色素C（Cyt C）的释放。当Bax、Bak与Bcl-2比例失衡，将导致电压依赖的阴离子通道（VDAC）开放和线粒体通透性转化孔（PTP）形成，进而引起MMP的降低和促凋亡内容物，如Cyt C、细胞凋亡诱导因子（AIF）、细胞凋亡诱导因子核酸内切酶G（Endo G）等的外漏[16-17]，Bik亦参与PTP的形成和促凋亡内容物的释放[17]。释放的Cyt C与胞质的凋亡肽酶激活因子-1（Apaf-1）形成复合物，暴露caspases募集结构域（CARD），导致caspase-9发生二聚化，产生37kD的活性片段[18]。因此，本研究进一步检测了GA对MMP和cleaved caspase-9表达的影响，结果提示GA作用后MMP明显降低、cleaved caspase-9表达显著增加，证实线粒体凋亡途径参与了GA诱导的肺癌细胞凋亡。

线粒体凋亡途径的活化启动了caspase级联反应，进而完成caspase-3对底物PARP的剪切灭活[19]。本研究证实GA作用后，H1975细胞表达17、19kD的caspase-3活化片段增加，且随着GA浓度增高而进一步增加；同时其底物PARP被剪切成89kD的、不具有结合损伤DNA能力的片段，导致受PARP负调控的核酸内切酶活性增高，降解核小体DNA引起细胞凋亡[20]。

综上所述，GA通过增加H1975细胞内源性ROS含量，激活JNK信号通路，导致促凋亡蛋白Bax、Bak、Bik与抗凋亡蛋白Bcl-2表达失衡，进而引起MMP降低和线粒体凋亡途径激活，最终诱导肺癌细胞凋亡。

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ObjectiveTo investigate the effec t of gambogic acid(GA)on apop tosis of human lung cancer H1975 cells and its mechanism s．and JNK signaling pathway in killing lung cancer cells by GA．MethodsHuman lung cancer H1975 cells were treated w ith GA(1,2．5 and 5μmol/L)．Cellp roliferation was analyzed by MTT assay;cellapop tosis was detected by Annexin V-FITC/PI doub le staining．The Reactive oxygen species(ROS)was measured by DCFH-DA method;the changes ofm itochond rialmemb rane potential(MMP)were detec ted by JC-1 p robe method;the activation of JNK signaling pathway and the exp ression ofm itochond rial apop tosis-related p roteins were detected by Western b lot．ResultsCompared w ith control g roup,the p roliferation of H1975 cells was inhibited by GA in a dose-dependentmanner(P＜0．05 or 0．01):the apop totic rates were increased by 25．2%,51．8%and 75．1%,after cells were treated w ith 1,2．5 and 5μmol/L of GA for 24h．The exp ression of c leaved caspase-9,c leaved caspase-3 and c leaved PARP in GA group were significantly higher than those in controlgroup in a dose-dependentmanner(P＜0．05 or 0．01)．Com pared w ith controlg roup,the ROS levels were significantly increased and the exp ression of phospho-JNK(p-JNK)was up-regulated after treated w ith GA for 2h．After treated by GA for 16 h,the MMP in GA g roup was dec reased significantly com pared w ith the controlg roup(P＜0．05)．GA increased the exp ression of p ro-apop totic p rotein Bax,Bak,Bik and dec reased the exp ression of p ro-survival p rotein Bc l-2(P＜0．05 or 0．01)．ConclusionGambogic acid can induce the apop tosis of human lung cancer H1975 cells through up-regulating the intracellular levelof ROS to activate JNK signaling pathway,the latter triggers loss of MMP and activation ofm itochond ria apop tosis pathways．

Gambogic acid Lung cancer H1975 cell Reactive oxygen species JNK signaling pathway Apop tosis