VEGF、EGFR及Parkin蛋白在鼻咽癌中的表达及三者间的相关性研究

周珍 李旋 倪海峰 汤建国 李勇 江波

●论 著

VEGF、EGFR及Parkin蛋白在鼻咽癌中的表达及三者间的相关性研究

周珍 李旋 倪海峰 汤建国 李勇 江波

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子受体（EGFR）及Parkin蛋白在鼻咽癌（NPC）中的表达情况以及三者间的相关性。方法应用免疫组化SP法检测48例NPC组织和34例正常鼻咽部上皮组织中VEGF、EGFR及Parkin蛋白的表达，并探讨三者间的相关性。结果NPC组织中VEGF和EGFR蛋白表达阳性率明显高于正常鼻咽部上皮组织，Parkin蛋白表达阳性率则明显下降，且均有统计学差异（均P＜0．05）。NPC组织中VEGF蛋白表达与NPC患者有无淋巴结转移及临床TNM分期密切相关（均P＜0．05），而与患者的年龄、性别、病理类型、T分期均无关（均P＞0．05）；EGFR和Parkin蛋白表达与NPC患者有无淋巴结转移密切相关（均P＜0．05），而与患者的年龄、性别、病理类型、T分期、临床TNM分期均无关（均P＞0．05）。NPC组织中VEGF和EGFR蛋白的表达呈正相关（P＜0．05），Parkin和VEGF、EGFR蛋白的表达无相关性（均P＞0．05）。结论VEGF、EGFR及Parkin蛋白与NPC发生、发展有关，VEGF、EGFR及Parkin蛋白表达可作为NPC的预后判断指标，NPC中VEGF和EGFR可能起协同作用，而Parkin则可能单独发挥作用。

鼻咽癌 血管内皮生长因子 表皮生长因子受体 Parkin 蛋白表达

血管内皮生长因子（VEGF）是目前所知作用最强的促血管生成因子之一[1]。VEGF作用于血管内皮细胞，与血管内皮细胞上的表皮生长因子受体（EGFR）结合，通过信号转导，促进内皮细胞分化及血管生成[2]。肿瘤微血管密度（MVD）与肿瘤的生物学行为密切相关。同时，研究已证实Parkin基因在多数肿瘤中是一种新的候选抑癌基因，但在鼻咽癌（NPC）中的相关研究少见，而对于VEGF、EGFR及Parkin三者在NPC组织中表达的联合研究尚未见于报道。本研究用免疫组化方法检测了NPC组织中VEGF、EGFR及Parkin蛋白的表达，旨在探讨三者在NPC发生、发展中的作用及其相关性。

1 对象和方法

1.1 对象 本实验通过医院伦理委员会批准，所有标本在采集前都与患者及志愿者签订知情同意书。收集2010至2013年耳鼻喉科门诊及住院治疗的新发NPC患者共48例，其中杭州市肿瘤医院32例，浙江大学医学院附属邵逸夫医院16例。其中男37例，女11例；年龄18～76岁，中位年龄56.5岁。NPC病理诊断参照2005年WHO分型：非角化型癌41例、角化型鳞状细胞癌7例、基底细胞样鳞状细胞癌0例。临床TNM分期参照国际抗癌联盟（UICC）2010年第7版：Ⅰ期11例、Ⅱ期11例、Ⅲ期16例、Ⅳ期10例。所有患者术前均未接受放、化疗以及非甾体抗炎药物治疗。另外收集杭州市第一人民医院耳鼻咽喉头颈外科鼻窦内镜手术患者的正常鼻咽部上皮组织标本34例作为对照组，其中男18例，女16例；年龄19～68岁，中位年龄48.7岁。两组年龄及性别构成均无统计学差异（均P＞0.05）。

1.2 主要试剂 鼠抗人VEGF一抗购自福州迈新生物技术开发公司，阳性对照为该公司提供的胃癌标本。鼠抗人EGFR一抗购自上海基因公司，阳性对照为本院病理科提供的食管癌标本。鼠抗人Parkin一抗购自Aabcam公司，阳性对照采用该公司提供的正常肝组织阳性染色标本。三者的阴性对照标本采用0.01mmol/L的磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗。免疫组化ElivisionTMSP试剂盒为福州Maixin-Bio公司产品。

1.3 方法 所有标本切除后立即用10%甲醛溶液固定，送病理科石蜡包埋后连续切片，片厚3μm，分别行常规HE染色及免疫组化染色。石蜡切片经65℃电热恒温鼓风干燥3h，放置待用。免疫组化ElivisionTMSP法染色，具体步骤按照试剂盒操作说明书进行。

1.4 结果判断 采用Olympus显微镜观察切片HE染色情况。免疫组化检测均设有已知阳性对照和用PBS代替一抗的阴性对照，VEGF及Parkin阳性表达均定位于细胞质，EGFR定位于细胞膜，均呈棕黄色或棕褐色颗粒样分布。结果判定根据文献报道采用半定量计分法[3]，对每张切片的阳性细胞着色强度及阳性细胞率分别进行分级计分。染色强度计分：不染色计0分；轻度染色（淡黄色）计1分；中度染色（黄色）计2分；强染色（棕黄色或黄褐色）计3分。阳性细胞率计算：选择染色均匀区域，在400倍视野下计数阳性细胞占视野细胞总数的百分数，共计数5个视野，取平均值。阳性细胞率（0%、＜25%、25%～50%、＞50%）分别计分为0、1、2、 3分。按上述两项之和判断结果：0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～4分为阳性（++），5～6分为强阳性（+++）。蛋白表达阳性率=蛋白表达阳性例数/总例数× 100%。

1.5 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件，正常鼻咽部上皮组织与NPC组织间蛋白表达阳性率的差异、3种蛋白表达与NPC患者临床病理特征的关系均采用Wilcoxon秩和检验进行比较，相关性分析采用Pearson直线相关分析。

2 结果

2.1 NPC组织中VEGF蛋白表达及与患者临床病理特征间的关系 48例NPC组织中VEGF蛋白表达（-）0例、（+）9例、（++）18例、（+++）21例，总体表达阳性率100.00%；34例正常鼻咽部上皮组织中VEGF蛋白表达（-）17例、（+）17例、（++）0例、（+++）0例，总体表达阳性率50.00%。NPC组织中VEGF蛋白总体表达阳性率明显高于正常鼻咽部上皮组织（P＜0.05），见图1。VEGF蛋白在NPC中的表达与患者有无淋巴结转移及临床TNM分期相关（均P＜0.05），但与患者的年龄、性别、病理类型、T分期均无关（均P＞0.05），见表1。

图1 VEGF蛋白在NPC组织和正常鼻咽部上皮组织中的表达（A：正常鼻咽部假复层柱状上皮细胞胞质着色，呈棕色或棕黄色；B：NPC组织癌巢中癌细胞胞质着色，呈黄色或棕黄色；免疫组化Elivision SP法染色，×400）

2.2 NPC组织中EGFR蛋白表达及与患者临床病理特征间的关系 48例NPC组织中EGFR蛋白表达（-）0例、（+）3例、（++）14例、（+++）31例，总体表达阳性率100.00%，其中弱阳性、阳性和强阳性率分别为6.25%、29.17%和64.58%；34例正常鼻咽部上皮组织中EGFR蛋白表达（-）0例、（+）23例、（++）8例、（+++）3例，总体表达阳性率100.00%，但其中弱阳性、阳性和强阳性率分别为67.65%、23.53%和8.82%。两者的总体阳性表达率一致，但NPC组织中的EGFR蛋白表达阳性及强阳性率均高于正常鼻咽部上皮组织（均P＜0.05），见图2。EGFR蛋白在NPC组织中的表达与有无淋巴结转移相关（P＜0.05），但与患者的年龄、性别、病理类型、T分期、临床TNM分期均无关（均P＞0.05），见表2。

表1 NPC组织中VEGF蛋白表达与患者临床病理特征的关系

表2 NPC组织中EGFR蛋白表达与患者临床病理特征的关系

2.3 NPC组织中Parkin蛋白表达与患者临床病理特征间的关系 48例NPC组织中Parkin蛋白表达（-）21例、（+）19例、（++）8例、（+++）0例，总体表达阳性率56.25%；34例正常鼻咽部上皮组织Parkin蛋白表达（-）0例、（+）2例、（++）11例、（+++）21例，总体表达阳性率100.00%，NPC组织中Parkin蛋白总体表达阳性率明显低于正常鼻咽部上皮组织（P＜0.05），见图3。Parkin蛋白在NPC中的表达与有无淋巴结转移相关（P＜0.05），但与患者的年龄、性别、病理类型、T分期、临床TNM分期均无关（均P＞0.05），见表3。

图2 EGFR蛋白在NPC组织和正常鼻咽部上皮组织中的表达（A：正常鼻咽部假复层柱状上皮细胞胞膜着色，呈棕色或棕黄色；B：NPC组织癌巢中癌细胞胞膜着色，呈黄色或棕黄色；免疫组化Elivision SP法染色，×400）

图3 Parkin蛋白在NPC组织和正常鼻咽部上皮组织中的表达（A：正常鼻咽部假复层柱状上皮细胞胞质着色，呈棕色或棕黄色；B：NPC组织癌巢中癌细胞胞质着色，呈黄色或棕黄色；免疫组化Elivision SP法染色，×400）

2.4 NPC组织中VEGF、EGFR及Parkin蛋白表达的相关性 EGFR蛋白表达与VEGF蛋白表达呈正相关（r= 0.497，P＜0.05），散点图见图4。而Parkin蛋白的表达与VEGF及EGFR蛋白表达均无相关性（r=0.144、-0.0751，均P＞0.05）。

3 讨论

目前普遍认为肿瘤的发生、发展与癌基因的激活、抑癌基因的失活以及两者的表达失衡所导致的细胞增殖和凋亡异常密切相关。NPC是头颈部最常见的恶性肿瘤，容易早期发生淋巴结转移。

VEGF可以通过旁分泌或自分泌的形式与血管内皮细胞特异性结合，能增强血管通透性，促进血管内物质的渗出，同时刺激血管内皮细胞的增殖并抑制其凋亡，激活蛋白酶致使细胞外基质降解，有利于肿瘤新生血管生长及延伸，在肿瘤血管形成的多个环节中起重要作用，从而影响肿瘤的生长和转移[4]。许多研究表明，VEGF可在大部分人类肿瘤中表达，与肿瘤组织MVD成正比，参与肿瘤的发生、发展、浸润及转移。另有研究发现VEGF在肺癌、乳腺癌、结肠癌、肾细胞癌、恶性胶质细胞瘤等多种肿瘤中均呈高表达，且VEGF的表达情况与肿瘤患者生存期及转移相关，VEGF高表达者易发生肿瘤转移，生存期短。Joo等[5]和Bran等[6]研究证实VEGF与头颈部肿瘤的关系密切。Krishna等[7]研究表明，高滴度EB病毒感染的NPC组织中VEGF表达较高，因此认为EB病毒感染能够上调VEGF的表达，促进NPC血管生成。近几年的研究表明，NPC的发生、发展、转移及预后与其血管生成有着密切的关系。VEGF表达水平与肿瘤的恶性程度、转移情况、MVD等呈正相关，与患者的预后呈负相关。以VEGF信号转导通路为靶点的肿瘤靶向治疗已在多种肿瘤中取得了实质性的疗效。

表3 NPC组织中Parkin蛋白表达与患者临床病理特征的关系

图4 NPC组织中EGFR与VEGF蛋白表达相关性散点图

EGFR的高表达可导致癌变，促进肿瘤细胞生长、侵袭、新生血管形成及远处转移[8]。VEGF和EGFR是恶性肿瘤细胞形成过程中的重要基因调控靶点，两者促进了肿瘤的发生、发展并参与了肿瘤的浸润和转移[9]。NPC细胞能分泌表皮生长因子（EGF），通过EGF/EGFR自分泌环路促进自身增殖和转移，也能通过Ras/ MAPK、PI3K/AKT等信号传导途径，继而导致肿瘤细胞的分裂增殖，同时促进肿瘤血管生成[10]。

Parkin基因被定位为帕金森病的致病基因，其主要功能是参与蛋白质的泛素化过程。近年来研究证实Parkin在乳腺癌[11]、卵巢癌[12]、肝癌[13]、白血病[14]等多种肿瘤中起抑癌基因作用，但是Parkin蛋白在肿瘤中的作用与蛋白质的泛素化过程并无明显相关性，而是通过增强细胞周期依赖性蛋白激酶6的表达使细胞周期阻滞于G1期，从而抑制细胞增殖来实现的，或者通过激活β-连环蛋白促进卵泡抑素表达，加速肝细胞增殖。

虽然国内外关于VEGF、EGFR与肿瘤的关系已有大量研究报道，但是NPC中的相关研究报道不多，对Parkin基因的研究更少见。本研究结果显示，NPC组织中VEGF及EGFR的蛋白表达显著高于正常鼻咽部上皮组织，而Parkin蛋白表达明显下调，既往与文献报道一致。

本研究结果进一步显示VEGF在NPC中的表达与患者有无淋巴结转移及临床TNM分期有显著相关性，但与患者的年龄、性别、病理类型无关，提示VEGF可能有助于促进NPC局部浸润及淋巴结转移，可作为判断NPC临床预后的预测指标，同时也为临床开展针对VEGF的肿瘤靶向治疗提供理论依据。Laskin等[15]的研究结果显示EGFR在NPC组织中的表达阳性率为25.00%～95.00%。EGFR表达阳性率不同可能与不同地区的NPC病理类型构成不同，以及生物学行为存在差异有关。Cao等[16]研究表明EGFR的表达与晚期NPC的临床TNM分期及T分期相关，与N分期无关。本研究显示EGFR在NPC中的表达与有无淋巴结转移有显著相关性，但和患者的年龄、性别、病理类型、T分期及临床TNM分期无相关性，与Cao等[16]的研究结果不一致。笔者分析认为，Cao等[16]研究对象为晚期NPC患者，均合并淋巴结转移，而本研究对比的是N0期与N1～3期的患者，分析的是有无淋巴结转移的患者间的差异，研究对象的类型不同从而引起研究结果不一致。Mehdi等[12]报道Parkin基因转录表达与卵巢癌患者年龄、病理分级、临床TNM分期、是否绝经无关，而本研究结果显示，Parkin蛋白表达与NPC患者有无淋巴结转移密切相关，而与患者性别、年龄、T分期、临床TNM分期、病理类型等临床病理特征均无明显关系，提示Parkin蛋白可能在不同肿瘤中发挥不同作用机制。本研究证实Parkin蛋白表达在有淋巴结转移的患者中明显下调，表明Parkin蛋白表达下调可能有利于癌细胞通过淋巴扩散转移，患者预后可能更差，因此，Parkin蛋白表达也可作为临床上判断NPC患者预后的一个预测指标。

肿瘤的发生、发展是一个多步骤、多因素参与的复杂生物学过程，抑癌基因的失活及癌基因的活化，在时间和空间上相互配合，协同促进了细胞的癌变，伴随着肿瘤发生、发展和转移的各阶段。本研究显示在NPC中EGFR和VEGF表达呈正相关，具有相互协同效应，可以推测两者在NPC致病中可能有共同或相关途径存在，VEGF诱导的对细胞基底膜的降解及EGFR与VEGF结合后对细胞间黏附能力的破坏可能是NPC转移的机制之一。两者共同发挥作用，共同调控NPC的发生及发展，而两者与Parkin表达均无关，提示Parkin与VEGF、EGFR可能通过不同机制发挥作用，其具体机制有待进一步深入探讨。

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ObjectiveTo investigate the exp ression of VEGF,EGFR and Parkin p roteins in nasopharyngeal carcinoma (NPC)and their c linicalsignificance．MethodsImmunohistochem ical(ElivisionTMSP)method was used to detec t the exp ression of VEGF,EGFR and Parkin p roteins in 48 specimens of NPC tissue and 34 specimens ofnormalnasopharyngealep ithelia tissue．The relationship between p rotein exp ression and c linicopathologicalparameters was analyzed．ResultsCom pared w ith normal nasopharyngeal ep ithelial tissue,the exp ression of VEGF and EGFR p rotein in NPC tissue was increased significantly,the exp ression of Parkin p rotein was significantly dec reased(P＜0．05)．The exp ression of VEGF p rotein was correlated w ith N stage and TNM c lassification ofNPC(P＜0．05),butwas notcorrelated w ith age and sex of patients,T stage and histopathologicalsubtypes ofNPC(P＞0．05)．The exp ression of EGFR and Parkin p rotein was correlated w ith N stage(P＜0．05),butwas not correlated w ith age and sex ofpatients,T stage,TNM c lassification and histopathologic subtypes ofNPC(P＞0．05)．The exp ression of VEGFand EGFR p rotein in NPC tissue was positively correlated w ith each other．The exp ression of Parkin was not correlated w ith exp ression of VEGF and EGFR(P＞0．05)．ConclusionIn NPC the exp ression of VEGF,EGFR and Parkin is up regulated．The exp ression of VEGF,EGFR and Parkin p roteinmay be used as a p rognostic ind icatorof NPC．

Nasopharyngealcarcinoma VEGF EGFR Parkin Protein exp ression

2015-02-03）

（本文编辑：胥昀）

浙江省自然科学基金重点项目（2010C13025-2）

310002 杭州市肿瘤医院耳鼻咽喉头颈外科（周珍）；浙江大学医学院附属邵逸夫医院耳鼻咽喉头颈外科（李璇、汤建国）；杭州市第一人民医院耳鼻咽喉头颈外科（倪海峰、李勇、江波）

汤建国，E-mail：tangjg2006@aliyun.com