神经肽Y对小鼠小胶质细胞株N9细胞分泌TNF-α的影响

吴永波李琦军0500石家庄市公安局法医损伤检验鉴定室050000石家庄市第三医院创伤一科

神经肽Y对小鼠小胶质细胞株N9细胞分泌TNF-α的影响

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050000石家庄市第三医院创伤一科2

目的：探讨神经肽Y对小神经胶质细胞生成TNF-α的影响。方法：以Elisa方法检测培养液中TNF-α蛋白含量，以RT-PCR方法检测小胶质细胞中TNF-αmRNA表达水平。结果：孵育各组N 9细胞6 h后，LPS组培养液中TNF-α蛋白的含量及N 9细胞中TNF-αmRNA表达水平显著高于Control组(P＜0.05)；LPS+NPY组TNF-α蛋白含量和mRNA表达水平与LPS组相比，显著降低(P＜0.05)；IBP 3226+NPY+LPS组IL-1β蛋白含量和mRNA表达水平与LPS+NPY组相比，显著增高(P＜0.05)。结论：NPY通过作用于NPY Y1受体降低小神经胶质细胞N 9的生物活性，抑制其生成TNF-α。

神经肽-Y；小神经胶质细胞；TNF-α

小胶质细胞巨噬细胞的一种，它的主要分布部位在中枢神经系统，主要参与免疫反应。MG还是大脑中产生炎症因子的主要细胞之一，当受到刺激后，MG成活化状态，可释放白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子等细胞因子以及活性氧、脂类等大量生物活性物质[1]，这些活性物质的过分释放会导致神经元损伤。神经肽Y(NPY)是一种广泛分布于中枢神经系统及周围神经系统的多肽，在神经元受到损伤时能够起到保护神经元的作用[2]。本实验中，我们采用经典激活剂LPS激活小鼠小胶质细胞N9细胞，检测其分泌的TNF-α的影响，与提前用NPY处理后的N9作对比，观察NPY是否能够降低N9的TNF-α的分泌水平。

资料与方法

N9细胞培养及形态学观察：复苏N9细胞，置于25 cm2培养瓶，用含10％血清的DMEM，培养基培养，隔日换液，至细胞铺满瓶底后传代，供实验用。

细胞形态学观察及纯度鉴定：N9细胞接种于内置预涂多聚赖氨酸盖玻片的培养板，培养3 d后取出盖玻片，IBA-1抗体荧光染色，封片后荧光显微镜观察N9细胞形态。

N9细胞分组及处理：以1×105/mL的浓度将N9细胞种于预铺多聚赖氨酸的六孔板内，3mL/孔，培养3 d后换新鲜无血清培养基培养孵育12 h，将各孔随机分为五组。CON组为正常对照组，以无血清培养基孵育N9细胞6 h，LPS组是以含终浓度为100 ng/mL LPS的无血清培养基孵育N9细胞6 h，NPY+LPS组是先以含NPY的无血清培养基孵育N9细胞半小时，然后加入LPS继续孵育6 h，NPY组是以含NPY(终浓度1μM)无血清培养基孵育N9细胞6 h，BIBP 3226+NPY+ LPS组先用含NPYY1受体阻滞剂BIBP 3226的无血清培养基孵育N9细胞半小时[3]，余步骤同NPY+LPS组。6 h后用ELISA法检测培养基中TNF-α的含量。六孔板中的N9细胞留作PCR检测用。

各组培养液中TNF-α蛋白含量的测定：按照Elisa试剂盒说明书进行操作，在坐标纸上绘出标准曲线。根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度[4]。

各组N9中TNF-αmRNA表达水平的测定：采用实时荧光定量PCR法检测上述各组小胶质细胞中的TNF-αmRNA表达水平。

统计学处理：利用SPSS 10.0统计分析软件进行统计学处理，经正态性检验和方差齐性检验，数据符合正态性和方差齐性的要求，采用重复测量资料的方差分析，数据以(x±s)表示，P＜0.05，差异有统计学意义。

结果

N9及原代培养的小胶质细胞形态学观察：N9细胞经IBA-1染色后，可见N9细胞被染成红色。用不同培养液孵育N9 6 h后，观察培养液中TNF-α蛋白含量的变化。各组孵育N9 6 h后，LPS组和IBP3226+NPY+LPS组培养液中TNF-α的含量显著高于CON组(P＜0.01)；但LPS组和IBP3226+NPY+LPS组之间的差异无统计学意义。LPS+NPY组比LPS组TNF-α的含量明显降低(P＜0.01)，IBP3226+NPY+LPS组与LPS+NPY组相比，TNF-α的含量显著增高(P＜0.01)，NPY组与对照组之间的差异无统计学意义。说明NPY明显抑制了LPS导致的TNF-α的升高，这种效应可以被BIBP 3226阻断，NPY本身对N9生成TNF-α的量没有明显影响。

不同培养液孵育N9 6 h后，N9中TNF-αmRNA水平的变化：各组孵育N9 6 h后，LPS组和BIBP3226+NPY+LPS组中N9的TNF-αmRNA水平显著高于CON组(P＜0.01)；但LPS组和BIBP3226+ NPY+LPS组之间的差异无统计学意义。LPS+NPY组比LPS组MG的TNF-α mRNA水平明显降低(P＜0.01)，IBP 3226+NPY+LPS组与LPS+NPY组相比，MG的TNF-α的mRNA水平显著增高(P＜0.01)，NPY组与对照组之间的差异无统计学意义。结果说明，LPS可以明显提高MG的TNF-αmRNA水平，NPY可以抑制LPS的作用，BIBP 3226阻断NPY Y1受体后，NPY的作用消失。NPY对N9细胞的TNF-αmRNA水平没有影响。

讨论

本实验采用LPS为N9细胞的激活剂，在LPS处理N9细胞6 h后，N9细胞的免疫活性也随之增强，N9细胞培养液中TNF-α明显增高，而对照组中未发现较大的变化，两组之间的差异有统计学意义。LPS可以激活N9细胞，该过程可以受到多种因素的影响，而其中NPY可以明显地抑制激活过程，从而使N9细胞的激活减少，降低其产生TNF-α蛋白的量，并且能够大大降低TNF-αmRNA表达水平，NPY Y1受体会受到BIBP 3226的影响，对该受体产生阻断作用，会使得NPY对LPS激活N9细胞的抑制作用完全消失，该结果说明NPY对LPS激活N9细胞的抑制作用都是通过Y1受体产生的[5]。本研究表明NPY对静止期的小胶质细胞影响不大[6]。NPY对小胶质细胞的免疫活性有调节作用，能下调中枢神经系统内小胶质细胞的免疫活性[7]，抑制TNF-α的产生，这种作用是通过其Y1受体实现的。本研究为NPY以小胶质细胞为靶点治疗与炎症有关的中枢神经系统疾病提供了实验依据。

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Effectof neuropeptide Y on the secretion of TNF-αbym icroglia cell line N9 cellsofmouse

Wu Yongbo1,LiQijun2
Forensic Damage Inspection and Identification Room ofPublic Security Bureau ofShijiazhuang City 0500111
The FirstDepartmentofTrauma,the Third HospitalofShijiazhuang City 0500002

Objective：To explore the effect of neuropeptide Y on the secretion of TNF-αbymicroglia cells.Methods：The content of TNF-αin the culturemedium was detected by Elisamethod,and the expression levelof TNF-αmRNA inmicroglia cellswas detected using RT-PCRmethod.Results：After 6 hours of hatching N9 cells in all groups,the content of TNF-αin the culture medium of LPSgroup and the expression levelof TNF-αmRNA in N9 cellswere significantly higher than the controlgroup(P＜0.05).Compared with LPSgroup,in the LPS+NPY group,the content of TNF-αand the expression level of TNF-αmRNA were significantly lower(P＜0.05).Compared with LPS+NPY group,in the IBP 3226+NPY+LPS group,the content of IL-1βprotein and the expression level ofmRNA were significantly increased(P＜0.05).Conclusion：NPY reduced the biological activity of N9 of microglia cells through the effect of NPYY1 receptor,and inhibited the formation of TNF-α.

Neuropeptide-Y；Microglia cells；TNF-α

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.36.2