氯化铵及生物素对苹果白兰地挥发性香气成分的影响

曾朝珍，康三江，张永茂，张霁红，张 芳，张海燕

（甘肃省农业科学院农产品贮藏加工研究所，甘肃兰州730070）

氯化铵及生物素对苹果白兰地挥发性香气成分的影响

曾朝珍，康三江，张永茂，张霁红，张 芳，张海燕

（甘肃省农业科学院农产品贮藏加工研究所，甘肃兰州730070）

采用顶空固相微萃取(HS-SPME)-气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析添加氯化铵及生物素与无添加氮源对照发酵苹果白兰地酒中的香气成分。结果表明，250 mg/L氯化铵与10 μg/L生物素的交互作用使苹果白兰地发酵中酯类物质的相对含量从40.95%提高至64.94%，异戊醇的相对含量从14.79%降低至3.69%；辛酸乙酯在主要酯类物质中相对含量最高且随着生物素添加量的增加从17.07%增加至22.43%，构成了苹果白兰地特有的香味。

苹果白兰地；氯化铵；生物素；香气成分

苹果白兰地是以苹果为原料，经破碎榨汁、酒精发酵、蒸馏、橡木桶陈酿、勾兑调配而成的苹果蒸馏酒[1]。苹果白兰地与葡萄酒、果酒相比，具有以下特点：一是原料质量要求低，可以大量利用非商品果，实现苹果转化增值；二是蒸馏取其精华，弃其糟泊，充分获得发酵有益成分；三是节约粮食，缓解粮食危机，部分替代粮食酒，满足消费者的高度酒需求。氮源及维生素是酵母生长所必需的营养物质之一，苹果汁中氮源的缺乏会导致发酵缓慢[2]。生物素的缺乏同样如此，因为生物素与酵母的氮源代谢有关[3]。目前就关于氮源对苹果白兰地香气成分影响研究表明，苹果白兰地发酵中添加氯化铵有助于提高主要酯类物质的相对含量，降低异戊醇的相对含量[4]，而氮源及生物素交互作用对苹果白兰地香气成分影响的研究报道较少。本实验采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase micro-extractions，HS-SPME）方法对苹果白兰地酒中的香气成分进行萃取，结合气相色谱-质谱（gas chromatohraph-mass spectrum，GC-MS）法进行分析研究，比较氮源及生物素交互作用对苹果白兰地生产过程中挥发性成分的影响，为改善和提高苹果白兰地酒的风味提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）1023及1620：中国食品发酵工业研究院；富士苹果：采自甘肃庆阳市；氯化铵（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；偏重亚硫酸钠（分析纯）：无锡市晶科化工有限公司。

1.2 仪器与设备

HS-SPME萃取装置DVB/Carboxen/PDMS（50/30 μm）萃取器：美国Surpelco公司；TRACE DSQ型气相——质谱联用仪：美国Finnigan公司；YXQ-LS-75G型立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；PAL-1手持数显糖度计：日本Atago公司；PZJ-0.5型榨汁机：江苏科威机械有限公司；LRH-70型恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；ZNHW2000型智能电热套：上海科升仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 苹果白兰地加工工艺流程

1.3.2 酵母菌种的活化

取液体种子培养基100 mL装于250 mL三角瓶中，在无菌条件下每瓶接入酵母菌6环，28℃、150 r/min摇床培养48 h，4℃冰箱保存备用[5]。

1.3.3 苹果白兰地酒制备

苹果汁中添加250 mg/L氯化铵作为氮源及0、1 μg/L、10 μg/L三个水平的生物素并设置对照，取菌种浓度为106CFU/mL的两种酿酒酵母以6%的接种量按比例1∶1接种于装有600 mL苹果汁的三角瓶中，然后控制温度在20℃条件下发酵6 d。

1.3.4 分析方法

参照康三江等[4]对苹果白兰地挥发性香气成分的分析方法对本研究样品进行分析。

1.3.5 数据分析

由GC-MS分析得到的质谱数据运用计算机谱库在（NIST/WILEY）进行初步检索及资料分析，再结合文献进行人工图谱解析[6]。

2 结果与分析

2.1 不同处理苹果白兰地酒中GC-MS总离子流色谱图

采用固相微萃取法提取并利用GC-MS分析添加氮源及生物素和未添加氮源及生物素发酵苹果白兰地酒中的香气成分，其GC-MS总离子流色谱图如图1～图4所示。

2.2 不同处理发酵苹果白兰地香气成分分析

未添加氮源和添加氯化铵及生物素发酵的苹果白兰地酒通过GC-MS测定分析的各香气成分相对含量的鉴定结果如表1所示。

由表1可知，采用HP-SPME和通过GC-MS分析检测并经过计算机谱库（NIST）进行初步检索，未添加氮源发酵的苹果白兰地经鉴定共测得32种挥发性香气成分，其中酯类物质16种，醇类物质5种，羧酸类物质3种，烯烃类物质1种，烷烃类物质5种，酮类物质1种，其他香气物质1种，其相对含量依次分别为40.95%、31.22%、0.73%、0.55%、5.17%、0.04%、0.07%。

添加氯化铵发酵的苹果白兰地经鉴定共测得29种挥

发性香气成分，其中酯类物质18种，醇类物质5种，羧酸类物质2种，烯烃类物质1种，烷烃类物质2种，其他香气物质1种，其相对含量依次分别为46.34%、28.67%、0.25%、0.54%、0.24%、0.11%。

添加氯化铵及1 μg/L生物素发酵的苹果白兰地经鉴定共测得33种挥发性香气成分，其中酯类物质19种，醇类物质5种，羧酸类物质2种，烯烃类物质2种，烷烃类物质3种，酮类物质1种，其他香气物质1种，其相对含量依次分别为51.38%、27.88%、0.35%、0.66%、0.16%、0.04%、0.08%。

添加氯化铵及10 μg/L生物素发酵的苹果白兰地经鉴定共测得28种挥发性香气成分，其中酯类物质17种，醇类物质5种，羧酸类物质2种，烯烃类物质1种，烷烃类物质2种，其他香气物质1种，其相对含量依次分别为64.94%、13.87%、0.30%、6.68%、0.07%、0.04%。

2.3 不同处理苹果白兰地发酵主体香气成分分析

2.3.1 不同处理苹果白兰地发酵主要呈香物质相对含量

在GC-MS分析结果的基础上，对苹果白兰地酒中几种主要呈香物质的相对含量作了进一步分析，结果如表2所示。

由表2可知，在空白组和添加氯化铵及生物素发酵的苹果白兰地中，酯类和醇类占的相对含量较高，构成了不同处理条件下苹果白兰地发酵的主要香气成分。不同处理发酵的苹果白兰地主体挥发性物质的相对含量因生物素添加量的增加而存在差异，随着生物素添加量的增加，总的酯类物质的相对含量依次增加，其相对含量分别为39.10%、44.72%、49.83%和63.33%。苹果白兰地发酵中添加氯化铵有助于提高主要酯类物质的相对含量[4]，而生物素与酵母的氮源代谢有关[7]。生物素是丙酮酸羧化酶的辅助因子，这种酶能够催化丙酮酸向草酰乙酸的转化。草酰乙酸是α-酮戊二酸和天门冬氨酸的前体物质，同时也是氮源同化及其他氮化合物合成的重要中间物质。生物素与氨基酸代谢和脂合成有关[8]，其含量的改变可以影响酯类物质的生成。

2.3.2 不同处理对苹果白兰地发酵主要酯类物质含量的影响

不同处理对苹果白兰地发酵主要酯类物质相对含量的影响如图5所示。

由图5可知，除了己酸乙酯与月桂酸乙酯以外，各处理与对照及处理组之间对各种酯的相对含量影响差异均显著（P＜0.05）。对于辛酸乙酯和癸酸乙酯而言，二者受生物素影响变化趋势一致，即其相对含量随着生物素添加量的增加而增加。乙酸乙酯和乙酸己酯相对含量随着生物素添加量的增大而减少且在生物素添加量为1 μg/L时相对含量最高，提高生物素添加量至10 μg/L时其相对含量降低，其相对值低于添加氯化铵却高于空白对照；对于3-甲基-乙酸-1-丁酯相对含量变化具有与乙酸乙酯和乙酸己酯相似规律，但其生物素添加量为10 μg/L时的相对含量低于空白；而对于己酸乙酯而言，处理间虽然相对含量在生物素为1 μg/L时最大，但各处理己酸乙酯的相对含量均低于空白组，而月桂酸乙酯在生物素添加量为10 μg/L时相对含量最高且显著增加。由图5结果可知，辛酸乙酯的相对含量在所有酯中最高，辛酸乙酯略带有玫瑰、橙子的花果香气，是白兰地酒特有的香味[9]。

2.3.3 不同处理对苹果白兰地发酵3-甲基-1-丁醇含量的影响

不同处理对苹果白兰地发酵3-甲基-1-丁醇相对含量的影响结果如图6所示。

由图6可知，对于3-甲基-1-丁醇（异戊醇）而言，添加氯化铵及生物素发酵的苹果白兰地酒中3-甲基-1-丁醇（异戊醇）的相对含量低于空白组，且3-甲基-1-丁醇（异戊醇）随着生物素含量的增加而降低。异戊醇是高级醇的主要成分，但如含量过高，对人体会产生危害[10]。研究表明，外加氮源对高级醇的生成有很好的抑制作用[11]，可以降低3-甲基-1-丁醇（异戊醇）的相对含量[4]。高级醇可以通过氨基酸降解代谢路径或糖合成代谢路径生成[12-13]。而氨基酸和糖代谢途径都包含需要生物素的生化反应[14-15]。因此，生物素的缺乏可以影响铵态氮的利用，可以导致氨基酸合成和氮同化前体物质α-酮戊二酸的生成不足，进而会导致相应高级醇生成量的降低。

3 结论

结果表明，添加生物素进一步提高了苹果白兰地发酵中酯类物质总的相对含量，降低了异戊醇的相对含量。250 mg/L氯化铵与10 μg/L生物素的交互作用使苹果白兰地发酵中酯类物质的相对含量从40.95%升至64.94%，异戊醇的相对含量从14.79%降至3.69%；辛酸乙酯在主要酯类物质中相对含量最高且随着生物素添加量的增加从17.07%增至22.43%。

本实验为了提高苹果白兰地酒精发酵效率及香气成分的含量，就无机氮源与生物素在苹果白兰地发酵中对酿酒酵母代谢产物形成方面进行初步研究，而要探讨更多的香气成分形成对苹果白兰地品质的作用，还需要进一步深入研究有机氮源、不同碳源、泛酸等营养物质交互作用在苹果白兰地发酵中对酿酒酵母发酵特性的影响。

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[5]曾朝珍，张永茂，康三江，等.不同氮源及浓度对苹果白兰地酒发酵的影响[J].食品工业科技，2013，34（8）：205-209.

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Effect of ammonium chloride and biotin on the aromatic composition of apple brandy

ZENG Chaozhen,KANG Sanjiang,ZHANG Yongmao,ZHANG Jihong,ZHANG Fang,ZHANG Haiyan
(Agricultural Product Storage and Processing Research Institute,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070,China)

The aromatic compositions of apple brandys with and without the addition of ammonium chloride and biotin were analyzed by HS-SPME and GC-MS.Results showed that with the addition of ammonium chloride 250 mg/L and biotin 10 μg/L,the relative content of esters increased from 40.95%to 64.94%in apple brandy;the relative content of isoamyl alcohol reduced from 14.79%to 3.69%.Ethyl caprylate with the highest relative content in the main esters increased from 17.07%to 22.43%with increasing biotin addition,which constituted the unique flavor of apple brandy.

apple brandy;ammonium chloride;biotin;aroma compounds

TS261.4

A

0254-5071（2015）06-0072-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.016

2015-05-05

农业部现代农业产业技术体系建设专项资金资助（CARS-28）；甘肃省农业科学院果蔬贮藏加工创新工程学科团队项目（2014GAAS03）

曾朝珍（1981-），男，助理研究员，硕士，研究方向为食品发酵。