喷雾干燥法制备冰酒发酵剂的研究

蒋 丽，董 丹，邢亚阁，车振明，罗建峰

（1.西华大学生物工程学院食品生物技术重点实验室，四川成都610039；2.理县塔斯酒庄有限公司，四川阿坝藏族羌族自治州623100）

喷雾干燥法制备冰酒发酵剂的研究

蒋 丽1，董 丹1，邢亚阁1，车振明1*，罗建峰2

（1.西华大学生物工程学院食品生物技术重点实验室，四川成都610039；2.理县塔斯酒庄有限公司，四川阿坝藏族羌族自治州623100）

从四川藏区高原霞多丽冰葡萄渣中分离纯化出了一种菌株，经18S rDNA D1/D2序列鉴定为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum），并通过正交试验对保护剂的配方进行优化，单因素试验初步研究喷雾干燥的的条件。结果表明，喷雾干燥最佳保护剂的配方为脱脂奶粉7%，酵母浸粉5%，乳糖0.6%，黄原胶0.20%，得到的干菌粉中的活菌数为2.6×1010CFU/g；确定喷雾干燥实验最适条件为进口温度120℃，进样流量20 mL/h，保护剂与菌泥比例4∶1（g∶L），按上述条件得到的干菌粉的活菌数为2.4×108CFU/g。

喷雾干燥；发酵剂；保护剂

冰酒（ice wine）是一种甜葡萄酒。是指在气温较低时，利用在葡萄树上自然冰冻的葡萄酿造的葡萄酒。在我国，按照国家标准GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》的定义，冰葡萄酒是指：将葡萄推迟采收，当自然条件下气温低于-7℃使葡萄在树枝上保持一定时间，结冰，采收，在结冰状态下压榨，发酵酿制而成的葡萄酒（在生产过程中不允许外加糖源）[1-3]。冰酒酿造过程中离不开酵母菌的作用，它们将葡萄原料中的糖分转化成酒精，但是在自然发酵过程中不易被控制，而且发酵周期又长，酒品质量得不到保证[4-5]。活性干酵母发酵如果被大量引进国内，会造成国内的冰酒口味与国外的趋同化，没有了中国冰酒的特点，制约了具有中国地域特色冰酒的生产[6]。制备出四川专用冰酒发酵菌剂这不仅可以解决自然发酵中存在的问题，还能酿造具有地区特色的优质冰葡萄酒。

目前发酵剂的生产主要采用真空冷冻干燥和喷雾干燥，根据相关文献证明[7-9]，虽然真空冷冻干燥冻干的发酵菌粉具有相当高的活力，但是生产时间、产量较小、成本较高、不适合大批量的生产，而且产品成块状，不利于发酵使用，喷雾干燥在食品工业中，是一种生产率高，操作费用低的工艺[10-11]。因此本研究通过喷雾干燥方法制备冰酒专用发酵菌剂，优化发酵菌剂的制备工艺和参数，旨在找到一种高效率、低成本生产冰酒发酵菌剂的方法。为四川高原藏区跨越式发展过程中特色冰葡萄酒产业——冰葡萄酒专用发酵菌剂开发及在冰葡萄酒标准化生产中推广应用项目提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）X7：由塔斯酒庄提供的冰葡萄渣中分离所得。

多孔淀粉、酵母提取物：上海试剂二厂；脱脂奶粉：天津雀巢公司；阿拉伯胶、黄原胶、明胶（均为食品级）：天津市北方天医化学试剂厂；乳糖：山东浩瀚食品添加剂有限公司；三磷酸腺苷酶、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）、DNAmarker：天为时代有限公司；18S rDNAD1/D2扩增引物：上海生物工程有限公司；乙醇、乙酸、蔗糖：成都科龙化工厂。

1.2 仪器与设备

DHP-9052型电热恒温培养箱：黄石市恒丰医疗器械有限公司；YH-200小型喷雾干燥机：上海世远生物设备工程有限公司；DHP-9052型立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂实验仪器公司；ABI3700基因测序仪：北京新阳创业科技发展有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 基因组DNA提取和18S rDNA D1/D2区序列扩增及检测

参照文献[12]的试验方法对酵母菌的DNA进行提取，采用18SrDNA序列分析法对分离出的菌种进行分子鉴定[13]。PCR条件概括：聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）体系：30 μL重蒸水，5 μL 10倍PCR扩增缓冲液（Mg2+Free），6 μL MgCl2（25 mmol/L），4 μL三磷酸脱氧核苷酸（d NTP）（2.5 mmol/L），正向引物NS1（5-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3）和反向引物NS8（5-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3）各1 μL，1 μLTaq聚合酶（2.5 U/μL），2 μL总DNA模板。

PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，经30个循环后最终72℃保持10 min，然后等温度降到4℃停止运行。

将PCR产物经过仪器纯化后直接送去上海英骏生工有限公司用ABI3700基因测序仪进行测序，通过用Chromas参照正反序列图谱人工校对测序结果进行比对。根据测试菌株的D1/D2区序列，运用电脑上的Blast程序在Gen-Bank数据库中分别进行同源序列搜索[13]。

1.3.2 菌种活化培养与收集

将活化好的酵母菌X7，按4%接种量接入到酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基中，29℃培养24 h后，5 000 r/min、4℃离心15 min，弃去上清液，收集菌体。

1.3.3 保护剂优化单因素试验

（1）保护剂对葡萄汁有孢汉逊酵母的影响

发酵液中分别添加多孔淀粉、酵母提取物、脱脂奶粉作为菌剂的保护剂，这3种保护剂分别选取添加量为3%、5%、7%制成悬浮液。由于乳糖是用于维持酪蛋白复合物稳定性的必需品，因此选取乳糖添加量分别为0.2%、0.3%、 0.4%、0.5%制成悬浮液。利用喷雾干燥机对葡萄汁有孢汉逊酵母发酵液进行热风喷雾干燥，热风喷雾干燥的进口温度120℃，相应的出口温度选择为60～70℃，收集粉末状的固形物，即得发酵菌剂。

（2）抗热保护性胶体的选择

发酵液中分别添加阿拉伯胶、黄原胶、明胶作为抗热保护剂，3种保护剂分别选取0.1%、0.2%、0.3%的浓度进行添加。利用喷雾干燥机对葡萄汁有孢汉逊酵母发酵液进行喷雾干燥，进口温度选择120℃进行喷雾干燥，60～70℃是其出口温度，然后收集所得固形物，即得发酵菌剂。制备平板培养基，将菌剂进行悬浮稀释后进行平板培养，计算菌剂中活菌数含量，研究保护剂对葡萄汁有孢汉逊酵母喷雾干燥的影响。每组试验3个平行，从而选出比较理想的抗热保护性胶体。

1.3.4 正交试验

进行喷雾干燥保护剂的优化，在进口温度120℃、进样流量20 mL/L的条件下，结合实验室前期试验结果和相关文献，选取酵母提取物、脱脂奶粉、黄原胶、乳糖，进行4因素3水平的正交试验，喷干后测定样品活菌数，正交试验因素与水平见表1。

1.3.5 喷雾干燥条件单因素试验

喷雾干燥进口温度对样品的影响：设定进样流量是20 mL/h，保护剂与菌泥的比例是3∶1（g∶L），试验选择110℃、115℃、120℃、125℃和130℃作为进风温度进行试验。

喷雾干燥进料流量对样品的影响：设定保护剂与菌泥的比例是3∶1（g∶L），进口温度设定为120℃，在10 mL/h、15 mL/h、20 mL/h、25 mL/h和30 mL/h的进料流量下分别进行喷雾干燥。

保护剂与菌株配比对样品的影响：设定进样流量是20 mL/h和进风温度为120℃，将保护剂与菌泥分别按1∶1、3∶1、4∶1、8∶1、12∶1（g∶L）的比例混合后，在最优进口温度和进样流量条件下进行喷雾干燥，测定干燥粉的活菌数。

1.3.6 产品中活菌数和存活率的测定[16]

平板计数法：在超净台里进行无菌操作，称取1 g发酵菌粉溶解到10 mL的无菌蒸馏水中，然后进行逐级梯度稀释，选用能计数的3个梯度进行平板计数，用移液管向每个瓶皿注入l mL的该梯度的菌液，每个梯度做3个平行。向各个培养皿中倒入15～20 mL虎红培养基中，摇匀培养皿，轻轻放置在超净台直到培养基完全凝固。将培养皿倒置于28℃培养箱中，培养48 h后计数。活菌数计算公式如下：

活菌数（CFU/g）=每个瓶皿菌数的平均数×稀释倍数

2 结果与分析

2.1 酵母DNA的提取

标准品基因和目的基因的扩增电泳结果见图1。根据电泳图的亮斑可知，本次实验的DNA提取成功，可以进行PCR扩增18S rDNA。

由图1可知，所扩增片段的大小在1.5 kb～2.0 kb，和真核生物的18S rRNA/DNA基因片段大小一致，因此达到了对酵母的18S rDNA基因的PCR扩增目的。通过电泳检测的的完整的18S rDNA基因，送公司测序。根据序列比对结果，鉴定出该酵母菌为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）。

2.2 抗热保护剂对葡萄汁有孢汉逊酵母菌的影响

保护剂对葡萄汁有孢汉逊酵母喷雾干燥的影响结果如表2所示，试验结果表明，葡萄汁有孢汉逊酵母菌发酵液喷雾干燥过程中，添加保护剂对菌体细胞具有保护作用。由表2可知，不添加保护剂时，喷雾干燥后菌剂所含活菌数为35 CFU/g，添加保护剂后，菌剂中的活菌数明显提升，酵母浸粉作为保护剂优于多孔淀粉脱脂奶粉作为保护剂明显优于其他2种保护剂，5%的脱脂奶粉作为保护剂喷雾干燥所得的活菌数可达9.6×108CFU/g。这是因为脱脂奶粉含蛋白质含量高，而蛋白质作为壁材，在于其分子带有许多双水基团，在形成微胶囊时，亲水基深入水相，疏水基吸附于油溶性物质表面，这样对菌粉中的菌起到了保护作用[15]。虽然效果最佳的抗热保护剂是脱脂奶粉，但是用脱脂奶粉作为喷雾干燥的保护剂，其生产成本大，不利于工业生产，本试验采用脱脂奶粉和酵母浸粉的混合物进行喷雾干燥试验。

2.3 乳糖对葡萄汁有孢汉逊酵母菌的影响

乳糖在胶囊制剂的生产中可用来改善主要活性成分的流动性，使模孔填充均匀，并可能提高生产效率。乳糖是用于维持酪蛋白复合物稳定性的必需品，其对葡萄汁有孢汉逊酵母菌干燥的影响见表3。由表3可知，添加一定量的乳糖对菌起到了明显的作用，随着添加量的变化，其活菌数也随着变化。当添加0.4%的乳糖时，其活菌数最高，达到3.0×105CFU/g，超过这添加量后活菌数就降低。当喷雾干燥时，乳糖可保护酪蛋白复合物在乳中的溶解度。缺乏乳糖时，由于酪蛋白复合物不稳定，易分解，导致其含量约减少1/2，而补充乳糖时其含量恢复。

2.4 抗热保护性胶体的选择结果

由于喷雾干燥过程中设置的温度都比较高，对菌会有一定的伤害，因此必须选择保护剂。添加这三种抗热保护剂后，均对活菌起到了一定的保护作用，不同保护性胶体对葡萄汁有孢汉逊酵母菌活菌数的影响见表4。由表4可知，当没有添加抗热保护剂时，测得菌粉中的活菌数比加了抗热保护剂的菌粉活菌数少；这3种抗热保护剂的效果具有显著差异，结果表明，黄原胶的抗热效果最佳，明胶的抗热效果比阿拉伯胶的抗热效果好，当添加0.2%的黄原胶时，对菌的保护效果最好，菌粉中的活菌数能达到6.3×108CFU/g。故选择黄原胶作为最佳抗热性保护胶体进行后续试验。

2.5喷雾干燥保护剂的正交试验优化结果

由表5可知，4个因素的保护效果依次是：脱脂奶粉＞黄原胶＞乳糖＞酵母浸粉，最佳保护剂组成为A3B1C3D2，最佳保护剂组成为脱脂奶粉7%，酵母浸粉5%，乳糖0.6%，黄原胶0.20%，按上述条件得到的干菌粉中的活菌数为26.06×109CFU/g。从表6中方差分析可以看出，脱脂奶粉含量、乳糖和黄原胶含量对菌剂中活菌数都有着显著性的影响（P＜0.05）。

2.6 喷雾干燥条件单因素试验结果与分析

2.6.1 不同进口温度的影响

进口温度对发酵剂活菌数的影响见图2。由图2可知，发酵菌剂活菌数达到最高的是进口温度为120℃，活菌数为3.5×108CFU/g，发酵剂颜色呈米黄色，粉末状，具有酵母奶香味；当进口温度达到125℃时，活菌数极具降低，只有15×106CFU/g，发酵剂呈淡黄褐色，有细小的块状物，说明某些样品因进口温度过高而失活变形。故选择进口温度为120℃。

2.6.2 进样流量的影响

喷雾干燥时的进样流量大小对发酵菌粉的活力同样具有影响[17]。选择10 mL/h、15 mL/h、20 mL/h、25 mL/h和30 mL/h 5个不同流量进样，检测样品中的活菌数，结果如图3所示。由图3可知，菌粉中的活菌数会随着进样流量的变化而变化，且进样流量很小时，活菌数也少，当进样流量达到20 mL/h时，活菌数达到最大为4.2×108CFU/g，此后随着进样流量的增大活菌数降低，故选择进样流量为20 mL/h。

2.6.3 不同保护剂与菌泥配比例对菌剂活菌数的影响

将不同比例的保护剂与菌泥混合均匀，然后进行喷雾干燥，对样品中的活菌数进行测定，结果见图4。由图4可知，当使用保护剂的用量偏少时，活菌数明显偏少，不能对菌体起到有效的保护作用，导致在喷干过程中死亡；而当保护剂过多时，样品中菌体的比例变小，所以活菌数会有轻微的下降，也会造成保护剂的大量浪费。随着保护剂与菌泥比例的增加，菌剂中的活菌数也随着变大，当其比例超过4∶1（g∶L）时，活菌数不再增加，反而迅速下降，因此可确定保护剂与菌泥的最佳比例是4∶1（g∶L），此时活菌数量达到最大为3.52×108CFU/g。

3 结论

从四川藏区高原威代尔冰葡萄果实中分离纯化出的菌株，采用18S rDNA D1/D2进行了基因鉴定，鉴定出的酵母菌是葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）。然后对葡萄汁有孢汉逊酵母喷雾干燥保护剂和喷雾条件进行优化，保护剂采用4因素3水平的正交试验，4种添加物的保护效果依次为：脱脂奶粉＞黄原胶＞乳糖＞酵母浸粉，最佳配方为脱脂奶粉7%，酵母浸粉5%，乳糖0.6%，黄原胶0.20%，按上述条件得到的干菌粉中的活菌数为26.06×109CFU/g。通过单因素试验确定了喷雾干燥实验最适条件：进口温度120℃，进样流量20 mL/h，保护剂与菌泥比例4∶1（g∶L），按上述条件得到的干菌粉的活菌数为2.4×108CFU/g。

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Preparation of fermentation starter of ice wine by spray drying method

JIANG LI1,DONG DAN1,XING Yage1,CHE Zhenming1*,LUO Jianfeng2
(1.Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan,College of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China; 2.Lixian Tasijiuzhuang Co.,Ltd.,Chengdu 623100,China)

Hanseniaspora uvarumwas isolated from the fermentation process of the Sichuan Tibetan plateau Chardonnay Ice grape slag and identified using 18S rDNA D1/D2.The formula of different protective agents was optimized by orthogonal experiments,and the spray drying conditions were studied by single factor experiment.The results showed that the optimal formula of protective agents for spray drying was skim milk powder 7%, yeast extract powder 5%,lactose 0.6%,and xanthan gum 0.20%.The viable count was 2.6×1010CFU/g.The optimal spray drying conditions were inlet temperature 120℃,injective flow rate 20 ml/h,proportion of protective agent and cell 4∶1(g∶L).The viable number ofH.uvarumprepared by spray drying was 2.4×108CFU/g.

spray dying;fermentation starter;protective agent

TS261.1

A

0254-5071（2015）06-0062-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.014

2015-05-06

四川省科技支撑计划项目（2011SZ0284，2012SZ0117，13KCBZ0066）；2012年西华大学食品生物技术重点实验室开放研究基金资助项目（SZjj2012-005）

蒋丽（1989-），女，硕士研究生，研究方向为食品科学。

*通讯作者：车振明（1960-），男，教授，本科，研究方向为食品发酵技术。