黄伞多糖的研究进展

洒荣波，孙继政，高艳霞，唐瑜菁

（泰山医学院生命科学学院，山东泰安271000）

黄伞多糖的研究进展

洒荣波，孙继政，高艳霞，唐瑜菁

（泰山医学院生命科学学院，山东泰安271000）

黄伞多糖具有调节机体免疫力、抗肿瘤、降血脂、抗菌、抗氧化、抗衰老等多方面的生物活性，是目前最具开发潜力的食药用真菌多糖。该文对黄伞多糖的来源、菌丝体发酵工艺优化、多糖提取工艺优化、分离提取方法、纯化和组成鉴定、生物学活性进行了综述，以期对黄伞多糖未来的研究提供理论基础。

黄伞多糖；提取工艺优化；分离提取；组成鉴定；生物学活性

黄伞（Pholiota adiposa），又名柳蘑、黄蘑、多脂鳞伞，是一种商品价值较高的食药用真菌，是目前最具发展前景的10种珍稀菌类之一。黄伞多糖是从子实体、菌体丝以及发酵醪液等中分离出的一种高分子聚合物，这种聚合物具有多种生物活性，可以为生命物质提供骨架支撑及能量，还在细胞的生命活动中起调节作用。《Atlas des Champignons》中记载，黄伞是欧洲人最早试种的药食兼用的食用菌［1］。现在国外对于黄伞的研究主要集中于黄伞的药效学研究和DNA测定上［2］，其他方面的研究并不多见。国内对黄伞的研究较晚，直到21世纪初才逐渐开始，且仅限于在黄伞的野生驯化、生物学特性及人工栽培技术等方面进行研究。近年来大量研究表明，黄伞多糖具有调节机体免疫力［3-5］、抗肿瘤［6-8］、降血脂［9-10］、抗菌［11-12］等生物学活性，更多的生物学专家将黄伞多糖的研究作为当前的热点之一。

1　黄伞多糖的来源

黄伞多糖的来源途径主要有以下3种：（1）从天然黄伞子实体中提取；（2）从人工培养黄伞子实体中提取；（3）从发酵培养的菌丝体和发酵液中提取。自然界黄伞子实体生产较慢，且由于条件所限不易获得；人工栽培黄伞子实体生产周期长、产量低、成本较高，因而未得到全面开发。目前黄伞菌有效成分开发与应用的主要途径是液态发酵法，用发酵的菌丝体替代子实体作为食品、保健品或药品的原料。从液体深层发酵获得的菌丝体中提取黄伞多糖，是今后研究和发展的必然趋势。

2　黄伞发酵产菌丝体多糖工艺优化的研究进展

近年来，国内许多学者对黄伞发酵产菌丝体多糖进行了大量工艺优化方面的工作，这为开发利用黄伞资源奠定了基础。卜庆梅等［13］通过黄伞液体深层发酵培养基配方的单因素试验和正交试验分析，获得黄伞液体培养产胞外多糖最适宜的培养基为蔗糖2%、麦麸3%、硫酸镁0.15%、磷酸二氢钾0.25%。黄清荣等［14］通过在黄伞液体培养基中添加不同生长因子来探索黄伞液体菌种生长的最适生长因子及其相应浓度，以期为黄伞液体菌种在生产应用方面提供理论指导；实验结果表明，向黄伞液体培养基中加入α-萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、3-吲哚丁酸、L-谷氨酸、油酸和羧甲基纤维素钠等6种因子均对黄伞菌丝体生长和胞外多糖产量有一定影响。王谦等［15］对黄伞深层发酵培养基和培养条件进行了优化筛选，在单因素试验的基础上进行了正交试验，综合试验优化结果，获得黄伞深层发酵培养基组成为葡萄糖0.2%，豆饼粉2.0%，磷酸氢二钾0.5%，硫酸镁0.1%，酵母膏0.2%；深层发酵的培养条件为起始pH值6.0，培养温度25℃，摇瓶装量100 mL，摇床转速150 r/min，培养周期6 d。对黄伞深层液体发酵条件的优化研究，为黄伞液体菌种的应用研究奠定了技术基础。

3　黄伞多糖提取优化的研究进展

对黄伞多糖进行研究，首先要研究其提取工艺。提取黄伞多糖，首先要使黄伞多糖从细胞内释放，继而穿过基质，最终使其扩散到溶剂中，再将其收集起来的过程。因此众多学者正广泛关注此方面的研究进展。

为提升黄伞多糖的提取率，降低能源的损耗，减少提取所用时间，研究者针对提纯萃取方法也相应进行了优化改进。苏延友等［16］采用正交试验法对影响黄伞多糖产量的浸提比、浸提时间和乙醇沉淀体积分数等因素进行了优化，优化后的黄伞多糖最佳提取工艺条件为浸提比1∶20、浸提时间2 h、乙醇沉淀体积分数90%；张桂春等［17］对经过深层发酵的黄伞发酵醪液采取单因素试验和正交试验法，对提取黄伞胞外多糖的相关工艺技术进行了研究，最终获得黄伞多糖的最佳提取条件为醇沉时间10 h，乙醇醇沉体积分数90%，醇沉温度4℃，醇沉pH 7.0。李德海等［18］在单因素试验基础上，采取响应面法优化了微波辅助提取黄伞多糖的工艺条件，最终得到黄伞多糖最佳提取工艺条件为微波时间2 min，微波功率490 W，料液比1∶21，水浴时间1.6 h；在优化后的工艺条件下进行验证试验，最终黄伞多糖提取率为17.69%。

4　黄伞多糖的分离提取方法

4.1溶剂萃取法（热水浸提法）

由于多糖在有机溶剂中溶解度几乎为零，故溶剂萃取法是利用多糖的这种性质，向萃取液中加入高浓度乙醇、甲醇或丙酮，这样多糖可以从萃取液中沉淀出来，进行初步提纯，然后通过萃取获得粗多糖。张俐娜等［19］利用质量分数为0.9%的氯化钠水溶液、体积分数为85%的乙醇、质量分数为1%的草酸铵、质量分数分别为5%和0.05%的氢氧化钠和硼氢化钠以及质量分数分别为20%和2%的氢氧化钠和尿素提取出了4种杂多糖和2种葡聚糖；陈小丽等［20］研究了蛹虫草子实体多糖的提取工艺条件，利用碱法对蛹虫草子实体多糖进行提取，最终获得最佳提取工艺为向粗多糖溶液中加入8倍体积的0.5 mol/L氢氧化钠，先后提取3次，每次提取0.5 h。

由于溶剂萃取法使用的溶液极性较大，这种情况下一些易溶于水的物质（如蛋白质、糖苷类等）会被同时浸提出来，这样会导致萃取液在储存时较易变质，为进一步的提纯带来影响，且提取耗时费力。

目前常用的是热水浸提法。大多数种类的多糖能够在水中溶解，在热水中尤其如此，不同的是，在乙醇等有机溶剂中，则形成固态沉淀沉积下来，所以大多数实验室采用的多糖的提取制备方法是水提醇沉法。此方法主要是借助于热力学作用使黄伞菌细胞首先发生质壁分离，类似于水的液体会渗入黄伞质壁分离后的间隙，即细胞壁、细胞质中，将液泡中的物质溶解，使其穿过细胞壁，扩散到外部溶剂中［21］。李德海等［22］总结归纳黄伞粗多糖常用提取工艺基本过程有以下几步：脱水的黄伞菌株或菌丝→破碎处理→水提醇沉法→酶法提取辅之于超声加压提取→浓缩→乙醇沉淀→除杂质（Sevage法）→乙醇清洗→脱水处理→黄伞粗多糖。

热水浸提法的优点为实验提取设备简单，操作步骤方便快捷，提取成本低廉，适合大规模的工厂生产；不足之处是必须重复多次浸提，耗费时间和大量原料，且劳动强度大，更严重的是浸提次数的增加还会导致多糖的结构被破坏，进而导致其生物活性的部分丧失。

4.2超声波辅助加压提取法

超声波辅助高压提取多糖是一种物理破碎过程，这种方法的原理是利用超声波产生的空化作用形成高温和高压环境，这种空化作用会造成真菌细胞壁破裂。王谦等［23］利用超声法提取黄伞发酵液多糖，利用超声波辅助加压法从黄伞发酵醪液中提取多糖，通过单因素试验及正交试验确定最佳的多糖提取条件为超声波作用时间35 min，作用时压力0.12 MPa，提取时间39 min。

相对于常规的多糖提取方法，超声提取法具有自身的优点，如节约时间、节省原料、提取率高且无需加热，但是超声提取法的缺点也很明显，如超声时间不宜过长，时间过长会使多糖链断裂，且多糖的结构也会随之发生变化［24］。一般情况下，超声处理时间＞1 h，多糖的分子质量会减少80%。基于这个原因，在进行超声波辅助提取多糖时，不能使用过长的超声处理时间。

5　黄伞多糖的纯化与组成鉴定

5.1黄伞多糖的纯化

5.1.1除蛋白

目前，主要有3种方法用于多糖除蛋白。

Sevage法：将氯仿和正丁醇以5∶1体积比混合后，将混和液加入黄伞多糖的样品水溶液中不断振摇，振摇后于室温条件下静置1 h，然后进行离心以除去混和液中凝胶状蛋白质，如此反复多次直至将混和液中的蛋白质除尽。在除蛋白的方法中，Sevage法是比较经典的方法，它的缺点是步骤繁琐、耗时较多，更重要的在除蛋白过程中多糖损耗较大。

氟里昂-113法：将氟里昂-113和黄伞多糖溶液按1∶1比例混合，然后在4℃条件下搅拌10 min左右，静置10 min后3 000 r/min离心吸取上清液，此上清液即为无蛋白的多糖溶液。这种方法的优点是效率较高，但也有明显的缺点，由于氟里昂-113沸点较低，只适合在实验室小规模条件下使用，不适合于工业化大规模使用。

三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）法：在多糖水溶液中滴加3%TCA，当多糖溶液由浑浊变澄清结束，室温条件下放置过夜，然后于5～10℃的条件下3 000 r/min离心10 min，除去沉淀后可以得到除蛋白的多糖溶液［25］。TCA法的缺点是过程操作比较剧烈，很容易引起某些多糖的降解。

5.1.2黄伞多糖的脱色

游离色素和结合色素两种色素一般情况下会存在于粗多糖中。色素脱除方法很多，比较常用的脱色方法主要有氧化法、离子交换法、吸附法、金属络合物法。

二乙氨乙基（dicthylaminoethyl，DEAE）-纤维素法是其中应用最为广泛的色素脱除方法。它的原理是黄伞多糖溶液通过离子交换柱，这样一方面可以对黄伞多糖溶液进行脱色，另一方面还可以初步分离黄伞多糖。DEAE-纤维素法常用H2O2作为氧化法的脱色氧化剂，其操作温度一般在4℃左右，操作浓度也不宜过高，这样可以避免多糖的部分降解。该法也有它的不足之处，黄伞多糖溶液中的色素被脱色氧化剂氧化后，提取液中仍然会存在，这样就会导致最终提取的多糖质量不高。另一种较为常用的脱色法是吸附脱色法，通过采用活性炭、硅藻土等作为吸附剂，色素附着于吸附剂达到脱色的目的，其缺点是吸附剂吸附色素的同时，也会吸附一部分多糖，这样就会造成多糖的损失。对于有些多糖溶液，其中不仅含有游离蛋白，而且还含有色素，为了达到提纯的目的，必须通过生成金属络合物的方法除去蛋白和色素。方法是向多糖提取液中加入菲林试剂，生成易于分离的不溶性络合物，经过分离后的络合物使用阴离子交换树脂进行分解。

5.1.3黄伞多糖小分子杂质的去除

黄伞多糖溶液中除了含有蛋白和色素外，含有大量小分子杂质。多糖中的小分子杂质可以通过逆向水流透析、超速离心或用孔径不同的滤膜进行超滤去除。

5.2黄伞多糖组分鉴定

聂永心等［26］将黄伞粗多糖经Sevage法脱蛋白与活性炭脱色得到精制黄伞多糖。通过对其水解衍生由色谱方法测得黄伞子实体多糖的单糖组分为木糖、甘露糖、葡萄糖，各单糖百分含量分别为1.03%、2.30%和96.7%。惠丰立等［27］对黄伞进行营养成分分析，发现黄伞中粗脂肪含量比普通食用菌要低，而多糖含量比普通食用菌要高，含量可以超过4%；黄伞中所存在的氨基酸种类丰富，有18种，与其他种类食药兼用菌所相比，有较高的含量。褚学英等［28］发现，黄伞所含有的蛋白质中，异亮氨酸（isoleucine，Ile）和赖氨酸（lysine，Lys）两种氨基酸的含量比较高。由于一般谷物中Ile和Lys这两种氨基酸的含量较低，因此可以把黄伞多糖与谷物在食用时相互补充，这样就可以使蛋白质起到互补作用，从而可以进一步提高食物当中的蛋白质的营养价值。

6　黄伞多糖的生物学活性

6.1机体免疫调节作用

有实验表明，黄伞多糖具有多种生物活性药理功能，如抗菌、抗氧化、美容美白等作用，免疫调节作用是特别需要强调的［29］。在目前已知的众多真菌多糖化合物中，具有免疫调节功能，激活或提高肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）的吞噬能力是大多数真菌多糖化合物所具有的作用［30］。将T细胞和B细胞活化，进一步激活补体，可以增加干扰素和白细胞介素的产生［31］。苏延友等［32］从泰山黄伞中提取出黄伞多糖，应用于动物实验研究了黄伞多糖的药理学作用，观察黄伞多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的激活效应。实验结果表明，黄伞多糖可以提升实验用小鼠的免疫作用，通过激活巨噬细胞、增强细胞因子分泌、提高NO的产生水平、增强吞噬致病因子的能力以及体外杀伤活性等多种途径来调节免疫系统。

6.2抗肿瘤作用及促进非特异性免疫功能

由于多糖可以激活免疫细胞，并且可以调整机体的免疫应答能力，但不会对宿主正常细胞产生毒副作用，因此多糖被看作一种可以调节生物效应的药剂［33］。蒋晓琴等［34］从泰山产黄伞子实体中提取出黄伞粗多糖，通过动物体内试验，向接种S180肉瘤细胞胃内灌注不同浓度的黄伞多糖溶液，连续操作12 d，观察黄伞多糖对荷瘤小鼠模型的机体非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫功能的影响。结果表明，黄伞多糖能提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用，增强非特异性免疫功能，显著提高荷瘤小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬指数与吞噬率以及外周血淋巴细胞转化率，最终可以显著提高血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量［35］。

6.3杀菌、抗感染作用

通过提高免疫系统在宿主体内的功能，激活或提高TAMs的吞噬能力是黄伞多糖在杀菌、抗感染方面发挥作用的主要原因［36］。另外，黄伞多糖可以预防葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎杆菌和结核杆菌的感染［37］。

6.4自由基清除作用

胡清秀等［38］对黄伞多糖的药理学作用进行了研究，结果表明，从黄伞子实体和菌丝体中提取的多糖均可以较好地清除自由基，且多糖质量浓度和对自由基的清除作用呈线性关系。在抗氧化多糖的研究过程中，有很多实验显示，多糖所起到的抗氧化活性，极有可能是多糖抗癌变、抑制细胞衰老、杀菌抗感染、抗射线辐射等其他活性的作用机理之一。而对于先导化合物进行一定程度的结构方面的改进，为多糖在抗氧化方面的发展前景贡献了一个不错的思路。

6.5机体保健作用

李德海等［22］在对黄伞多糖关于高血脂的作用研究时表明，黄伞多糖可以明显减少患有高血脂症小鼠的血清总胆固醇在血液中的比例。因此，黄伞多糖对于高血脂疾病有一定程度的预防作用。

7　展望

目前国内外的科学家从数量众多的高等担子菌中经过层层筛选，分离得到200多种有生物活性的多糖物质，发展至今已有数十年，市场上投放的已有上百种真菌多糖类保健品。在这些真菌多糖类保健品中，典型代表之一即为黄伞多糖。前人通过将黄伞多糖用于动物实验，证明黄伞多糖对于人类疾病的治疗以及保健均具有一定的积极作用，对黄伞多糖对于人类免疫功能的作用和提取分离工艺的研究，能够促进如黄伞这样的食药兼用真菌的进一步开发与深层次加工，但国内外对黄伞多糖的高级结构、合成途径、药理学机理以及深层结构与功能的关系研究的不够深入；与此同时，有必要进一步扩大黄伞多糖的实际应用领域，以此更大程度发掘黄伞多糖的应用潜能。

［1］DULGER B.Antimicrobial activity of the macrofungusPholiota adipose［J］.Fitoyerapia，2004，75（3-4）:395-397.

［2］KIM J H，LEE D Y，CHOI S H，et al.Effects ofLycii fructusand edible mushroom，Pholiota adiposa，on the quality and angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity of Korean traditional rice wine［J］.Food Biotechnol，2006，20（2）:183-191.

［3］宫春宇，胡清秀，韩永超，等.黄伞菌丝体多糖提取工艺及免疫调节作用研究［J］.食品工业，2012，33（8）：48-51.

［4］李德海，孙常雁，王占斌，等.黄伞子实体多糖的提取及免疫功能［J］.东北林业大学学报，2010，38（11）：115-118.

［5］宫春宇，郑玉萍，胡清秀，等.黄伞多糖的提取、纯化及增强免疫力功能研究［J］.食品科技，2013，38（4）：195-199.

［6］姜红霞，聂永心，苏延友.黄伞子实体多糖的结构初探及抗肿瘤活性研究［J］.时珍国医国药，2012，23（1）：139-141.

［7］蒋晓琴，丁晓明，刘海燕，等.黄伞粗多糖抗肿瘤及对荷瘤小鼠免疫功能影响的研究［J］.中国药师，2007，10（2）：119-123.

［8］赵永勋，李克颖，张跃华.多脂鳞伞菌丝体多糖抗肿瘤活性研究［J］.食用菌学报，2007，14（2）：49-52.

［9］李德海，王志强，孙常雁.黄伞子实体多糖的初步纯化及降血脂研究［J］.食品科学，2010，31（9）：268-271.

［10］王谦，张俊刚，王士奎，等.黄伞发酵提制物调节血脂作用的研究［J］.河北大学学报：自然科学版，2006，26（1）：101-103.

［11］黄年来.中国食用菌百科［M］.北京：中国农业出版社，1993.

［12］葛青.黄伞子实体多糖的分离纯化、结构鉴定及结构修饰研究［D］.杭州：浙江工业大学博士论文，2009.

［13］卜庆梅，韩立亚，黄清荣，等.黄伞胞外多糖液体培养基的优选［J］.食品科学，2007，28（8）：303-306.

［14］黄清荣，常林瑞，邢正刚，等.影响黄伞菌丝体及胞外多糖的几种因子的研究［J］.食品研究与开发，2007，28（1）：49-52.

［15］王谦，张俊刚，王士奎，等.黄伞深层液体发酵条件的优化研究［J］.安徽农业科学，2006，34（3）：498-499.

［16］苏延友，苏延峰，杨杰.正交试验法优选黄伞多糖提取工艺的研究［J］.食用菌，2004（1）：10-13.

［17］张桂春，辛晓林，黄清荣，等.黄伞胞外多糖提取条件探讨［J］.鲁东大学学报，2009，25（1）：65-67.

［18］李德海，王志强，孙常雁，等.微波辅助提取黄伞多糖及其初步纯化工艺［J］.东北林业大学学报，2010，38（5）：90-92.

［19］张俐娜，金勇，陈莉，等.人工培养菌种茯苓菌丝体多糖的分离、组成和分子量［J］.高分子学报，2003（1）：97-103.

［20］陈小丽，巫光宏，古青霞.蛹虫草子实体多糖的分离纯化［J］.生物技术，2011，21（4）：70-74.

［21］王雪冰，赵天瑞，樊建.食用菌多糖提取技术研究概况［J］.中国食用菌，2010，29（2）：3-6.

［22］李德海，孙常雁，王占斌，等.黄伞子实体多糖的提取及免疫功能［J］.东北林业大学学报，2010，38（11）：115-118.

［23］王谦，金黎明，巩竞，等.黄伞发酵醪液多糖提取条件初探［J］.食用菌，2009（1）：7-10.

［24］张昌军，原方园，邵红兵.超声波法在提取多糖类化合物中的应用研究［J］.化工时刊，2007，21（2）：54-56.

［25］董群，方积年，张志毅，等.汉防己多糖的研究［J］.生物化学与生物物理学报，1995，27（3）：261-265.

［26］聂永心.黄伞子实体多糖的分离纯化、结构鉴定及生物活性的研究［D］.泰安：山东农业大学博士论文，2011.

［27］惠丰立，魏明卉，刘征.黄伞子实体营养成分分析［J］.食用菌学报，2003，10（4）：20-23.

［28］褚学英.黄伞蛋白的营养价值［J］.南阳师范学院学报，2006，5（3）：57-58.

［29］全艳玲，解生权，庞清海，等.黄伞多糖提取优化［J］.中国酿造，2008，27（14）：67-68.

［30］宫春宇，胡清秀，韩永超，等.黄伞菌丝体多糖提取工艺及免疫调节作用研究［J］.食品工业，2012，33（2）：48-51.

［31］林应兴，田景芝，童金华.黄伞的研究进展［J］.亚热带农业研究，2009，5（2）：90-93.

［32］苏延友，康莉，杨志孝，等.黄伞多糖的提取及小鼠腹腔巨噬细胞的激活效应研究［J］.泰山医学院学报，2004，25（1）：9-11.

［33］张彩凤，田莉瑛，张雪梅，等.真菌多糖免疫调节活性的研究进展［J］.生命科学仪器，2008，6（10）：17-21.

［34］蒋晓琴，丁晓明，刘海燕，等.黄伞粗多糖抗肿瘤及对荷瘤小鼠免疫功能影响的研究［J］.中国药师，2007，10（2）：119-121.

［35］邓鹏.黄伞胞内与胞外多糖提取优化与抗氧化活性研究［D］.北京：中国农业大学博士论文，2011.

［36］王常荣.黄伞中抗氧化成分的分离鉴定及其抗HIV-1作用机制研究［D］.天津：南开大学博士论文，2013.

［37］郑敏，王亚平.中药多糖抗肿瘤的药理学研究进展［J］.国外医学：中医中药分册，2000，22（5）：259-263.

［38］胡清秀，宫春宇，闫梅霞.黄伞及黄伞多糖体外抗氧化作用的研究［J］.中南林业科技大学学报，2007，27（6）：57-62.

Research progress ofPholiota adiposepolysaccharide

SA Rongbo，SUN Jizheng，GAO Yanxia，TANG Yujing
（School of Life Sciences，Taishan Medical University，Taian 271000，China）

Pholiota adiposapolysaccharide has much biological activity，such as regulating immunity，anti-tumor，reducing blood lipid，antibacterial，anti-oxidation，anti-aging，and so on.It is the most potential edible and medicinal fungi polysaccharide for development.TheP.adiposapolysaccharide source，mycelium fermentation process optimization，polysaccharide extraction process optimization，extraction and separation method，purification and composition identification，polysaccharide biological activity were reviewed，in order to provide theoretical basis for future research ofP.adiposa polysaccharide.

Pholiota adiposapolysaccharide；extraction process optimization；separation and extraction；composition identification；biological activity

O636.1

A

0254-5071（2015）10-0009-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.003

2015-09-01

山东省自然科学基金项目（ZR2012CL02）

洒荣波（1978-），男，副教授，博士研究生，主要从事微生物发酵及生物活性物质应用研究工作。