黄曲霉毒素的提取、检测及防治方法研究进展

李从虎，刘毅然，李肖纯，邢朝凤，王志勇，黄晓平，2

（1.安庆师范学院生命科学学院，安徽安庆246011；2.泉州师范学院化学与生命科学学院，福建泉州362000）

黄曲霉毒素的提取、检测及防治方法研究进展

李从虎1，刘毅然1，李肖纯1，邢朝凤1，王志勇1，黄晓平1，2

（1.安庆师范学院生命科学学院，安徽安庆246011；2.泉州师范学院化学与生命科学学院，福建泉州362000）

黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉和寄生曲霉分泌的次级代谢产物，具有致癌、致畸和致突变的作用，主要损害机体的肝脏和肾脏等组织，对人类危害极大。该文介绍了黄曲霉毒素的危害、提取和检测方法，并综述了黄曲霉毒素的防治方法，为进一步加强黄曲霉毒素的控制提供参考。

黄曲霉毒素；检测；防治

黄曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是一类具有高度氧化杂环的真菌毒素，主要是由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）在霉变的食物（如坚果、花生、酱类等）中分泌的次级代谢产物［1］。这类真菌毒素自20世纪60年代被发现以来，已被确认为具有致癌、致畸和致突变作用的化合物，主要损害机体的肝脏、肾脏等其他多种组织［2-4］。为保证食品安全和促进人类健康，世界各国和地区对黄曲霉毒素均制定了严格的限量和进出口标准。欧盟规定在花生、干果等原料中黄曲霉毒素B1含量≤2 ng/g，而黄曲霉毒素总量≤4 ng/g［5］；我国规定黄曲霉毒素的限量标准为5～20 ng/g［6］。

在我国，由于某些企业生产过程开放、原料多样且管理不善等，使得黄曲霉毒素污染仍难以完全杜绝。为降低黄曲霉毒素的污染，国内外学者对其进行了科学的研究。黄曲霉毒素的分析通常包括3个主要步骤［7-9］：（1）提取，充分提取样品中黄曲霉毒素为后续的检测和防治提供有力保障；（2）检测，快速灵敏的检测提供了精确的数据来源；（3）防治，有效防治黄曲霉毒素污染，是保证食品安全和人类健康的根本。

本文综合国内外相关文献，综述了食品中黄曲霉毒素的提取、检测和防治方法，为进一步加强食品中黄曲霉毒素的控制提供参考。

1　黄曲霉毒素的提取

现行国家标准GB/T 18979—2003《食品中黄曲霉毒素的测定—免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法》介绍了大米、花生、植物油脂、酱油和食醋等食品中黄曲霉毒素的提取方法。其提取过程（以花生制品为例）：精确称取研磨（粒度＜2 mm）样品25.0 g置于250 mL具塞锥形瓶中，加入NaCl（5.0 g）和甲醇水混合溶液（甲醇∶水=7∶3）至125 mL，用匀质器高速搅拌2 min，随后用定量滤纸过滤，准确移取15 mL滤液并加入30 mL水稀释，最后用玻璃纤维滤纸过滤1～2次，至滤液澄清，备用［10］。COLE R J等［11］利用不同溶剂和不同溶剂/样品比例提取花生中的黄曲霉毒素，结果发现体积分数为80%甲醇水溶液和体积分数为90%乙腈水溶液分别在样本率为3∶1和2∶1时，黄曲霉毒素的提取效果最好；而体积分数为90%乙腈水溶液在样本率4∶1时提取效果最差。

此外，STARR J M等［7］采用超临界流体萃取技术（supercritical fluid extraction，SFE）在17.2 MPa和70℃等优化条件下得到土壤中黄曲霉毒素的回收率为72%。随后，SHEIBANI A等［12］将SFE技术进行改进，采用增压流体萃取技术（pressurized fluid extraction，PFE）提取开心果中的黄曲霉毒素，该法具有高回收率、低量和需要萃取溶剂较少的优点；研究结果表明，压力越高，回收率越高，在80℃和萃取溶剂流量为0.5 mL/min时，黄曲霉毒素回收率比AOAC法提取黄曲霉毒素高20%左右。

2　黄曲霉毒素检测方法

黄曲霉毒素的检测方法最初以薄层层析法为主，后发展到高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、免疫层析法和微柱筛选法等多种方法普遍应用。这类新方法和新手段为黄曲霉毒素的检测提供了广泛的选择余地，适应了不同的检测目的和要求。

2.1薄层层析法

薄层层析法（thin-layer chromatography，TLC）是最早被用来检测黄曲霉毒素的方法之一，其原理是利用黄曲霉毒素的荧光特性，根据荧光斑点的强弱与标准品进行比较而确定黄曲霉毒素的含量［13］。TLC法具有操作简单、成本低廉等优点，但具有对人和环境污染系数较大，且操作过程繁冗，灵敏度较低，处理多样品时工作量大等缺点。为了提高TLC法的精度，可将TLC法仪器化，通过薄层扫描法来测定黄曲霉毒素。BRADBURN N等［14］开发了双向高效薄层层析法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定黄曲霉毒素，该法将样品通过点板，氯仿-二甲苯-丙酮（6∶3∶1）混合溶液展开后，通过荧光光密度法在波长366 nm处检测黄曲霉毒素含量，以样品斑点面积积分值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，得到黄曲霉毒素含量。

2.2高效液相色谱法

高效液相色谱法定量测定黄曲霉毒素的工作原理是将样品中的黄曲霉毒素经柱层析分离后，通过测定色谱峰的面积实现定量检测。该法具有分析定量精准、稳定和灵敏度高等优点，已被广泛用于检测各种食品和粮食中的黄曲霉毒素［15］。GIRAY B等［16］利用安捷伦1100高效液相色谱仪、荧光检测器（激发波长360 nm，发射波长430 nm）和Spherisob S5ODS2柱分析了土耳其小麦样品中的黄曲霉毒素含量，其流动相为水∶乙腈∶甲醇（62∶16∶22，V/V），流动速率1 mL/min，进样量100 μL。结果显示，在41种小麦样品中的黄曲霉毒素的含量为10.4～643.5 ng/g。

目前，HPLC法已发展为多种方法相结合检测黄曲霉毒素含量。FU Z等［17］采用超高压液相色谱配紫外检测器法（ultra performance liquid chromatography-ultraviolet，UPLCUV）快速检测了玉米和花生中黄曲霉毒素的含量，该法将黄曲霉毒素经MycoSep#226 AflaZon+柱纯化，流动相为乙腈∶甲醇∶水（17.5∶17.5∶65），流速0.25 mL/min，检测波长360 nm，结果表明，该法对黄曲霉毒素B1、B2的检测限分别为0.32 ng/g和0.19 ng/g，定量限分别为1.07 ng/g和0.63 ng/g，回收率达到83.4%～94.7%。此外，免疫亲和柱高效液相色谱法（immunoaffinity column-high performance liquid chromatography，IAC-HPLC）具有快速、高效、灵敏、准确、安全等优点，已被广泛用于黄曲霉毒素的定量检测。该法的工作原理：利用抗原与抗体的特异吸附特性，免疫亲和柱只能特异性、选择性地吸附黄曲霉毒素，利用洗脱液将黄曲霉毒素洗脱下来进行检测。姜兆兴等［18］利用免疫亲和柱-高效液相色谱法配荧光检测器法测定饲料中黄曲霉毒素，其色谱条件为色谱柱为MYCOTOXTM黄曲霉毒素分析柱，柱温42℃，流动相甲醇∶乙腈∶水=22∶22∶56，流速1.0 mL/min，激发波长365 nm，发射波长430 nm，进样量10 μL，衍生液为0.05%碘液，衍生流速0.3 mL/min，反应管温度90℃；结果表明，该法对黄曲霉毒素的回收率高达84%以上，检测限达到0.5 ng/g。考虑到通过强氧化剂（三氟乙酸等）或卤族元素及其衍生物（碘、溴等）对黄曲霉毒素进行衍生时，由于这些试剂具有腐蚀性、挥发性，使得定量稳定性较差。马良等［19］将过渡金属离子（氯化汞）作为衍生剂与免疫亲和柱高效液相色谱相结合，用于黄曲霉毒素的荧光分析，结果表明，回收率为83%～100%，相对标准偏差1.51%～4.98%，黄曲霉毒素B1的检出限和定量下限分别达到0.05 ng/g和0.17 ng/g。

2.3酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorband assay，ELISA）是20世纪70年代初期出现的一种抗原与抗体的特异性结合而成的免疫分析新技术。该技术首先是抗原（抗体）结合到固相载体表面并仍具有免疫活性；其次抗体（抗原）与酶结合后仍保持免疫活性和酶活性；最后结合物与相应的抗原（抗体）反应后，结合的酶仍能催化底物，生成有色物质，而颜色深浅可定量抗体（抗原）的含量。应用于黄曲霉毒素检测时，黄曲霉毒素与定量特异性抗体反应，而游离抗体与固相包被抗原结合，同时加入酶标物和底物后显色并终止反应，与黄曲霉毒素标准曲线进行比较并由此定量计算出黄曲霉毒素的含量。ELISA法具有操作简单、灵敏度高、特异性较强和对环境污染较小等优点，已广泛用于食品、饲料和肉类等行业中黄曲霉毒素的检测［20］。

AYCICEK H等［8］利用ELISA法检测了土耳其2002年9月至2003年9月223种乳制品中黄曲霉毒素M1的含量，其中8.52%的样品中黄曲霉毒素M1含量超过土耳其食品委员会的限量标准。NURYONO N等［21］采用ELISA法检测了2006年印尼5个不同区域的113种新鲜乳制品中黄曲霉毒素M1含量，结果表明48种乳制品中黄曲霉毒素M1含量低于5 ng/L，31种样品中黄曲霉毒素M1含量为5～10 ng/L，34种样品黄曲霉毒素含量高于10 ng/L。PEI S C等［22］利用分离的单克隆抗体结合ELISA法分析了中国乳制品中黄曲霉毒素M1的含量，其回收率达到98%，检测限0.04 ng/mL。

2.4其他检测法

AMMIDA N H等［23］利用一种电化学免疫传感器，使用微分脉冲伏安法检测大麦中的黄曲霉毒素B1，检测限达到30 pg/mL。

VELKY J T等［24］设计了一种轻便、微型的免疫亲和荧光生物传感器，实现全自动、高灵敏度和快速定量检测黄曲霉毒素，其检测范围可达0.1～500 ng/g。

3　黄曲霉毒素防治方法

黄曲霉毒素具有较强的热稳定性，巴氏消毒不能解除黄曲霉毒素的污染。因此，自1960年黄曲霉毒素被发现以来，国内外众多学者研究了黄曲霉毒素的防治措施。迄今的研究成果可分为物理化学法和生物法两大类。

3.1物理化学法

物理化学方法主要是通过一些物理方法和化学试剂达到黄曲霉毒素的去毒目的，主要包括：吸附、热处理［25］、辐射、碱处理和氧化处理等方法。DESHENG Q等［26］用蒙脱石吸附黄曲霉毒素B1，发现在pH 2.0和8.0时，黄曲霉毒素B1的吸附率分别达到613.5 μg/g和628.9 μg/g，并证明其吸附机理是黄曲霉毒素B1吸附于蒙脱土的双氢键，但其分子并未渗透到蒙脱土的夹层区域中。INAN F等［27］采用臭氧质量浓度分别为33 mg/L和66 mg/L处理红辣椒60 min，可使红辣椒的黄曲霉毒素的去除率分别达到80%和93%。

3.2生物防治法

生物防治主要利用微生物或其代谢产物去除黄曲霉毒素，由于该法具有对处理对象无污染、高度专业，不影响处理对象的营养价值，而且能够避免其他毒素的产生等优点，因此成为黄曲霉毒素去毒研究和应用的热点。

利用微生物之间竞争机制，筛选出对产黄曲霉毒素生长有抑制作用的微生物作为拮抗菌，通过优化培养使其能够达到最佳抑制效果，是预防黄曲霉毒素污染的第一类重要方法。DORNER J W等［28-29］发现将不产毒的寄生曲霉菌株播撒在花生生长的土壤中可以使食用花生中黄曲霉毒素含量降低83%～98%；接种量越高，其对土壤中黄曲霉毒素的抑制越明显，且在接种2年后仍具有抑制作用。

通过微生物，如细菌、放线菌、酵母菌、霉菌菌丝体的吸附作用，是黄曲霉毒素去毒的第二类重要方法。这类微生物能够与黄曲霉毒素形成复合体，当形成复合体后，其对机体的吸附能力减弱，因而易与黄曲霉毒素一起排出体外，降低黄曲霉毒素的污染风险。NAGENDRA S等［30］发现2株乳杆菌和4株双歧杆菌对黄曲霉毒素B1的吸附能力达到20%～50%，用蒸馏水洗涤吸附黄曲霉毒素B1的菌体后，仍有10%～40%的黄曲霉毒素B1吸附在乳酸菌上，表明乳酸菌对黄曲霉毒素有较强的吸附作用，其吸附机理是黄曲霉毒素B1通过非共价方式与乳酸菌细胞壁的多聚糖组分结合形成复合物。也有研究报道称无论是活菌，还是经灭活的乳酸菌，对黄曲霉毒素B1均具有良好的吸附作用［31］。

基于微生物及其代谢产物降解黄曲霉毒素的目的是将黄曲霉毒素降解成无毒或低毒的物质。GUAN S等［32］利用嗜麦芽寡养单胞菌在37℃时培养72 h可去除82.5%的黄曲霉毒素B1，并探究了降解的影响因素，结果表明37℃和pH 8.0时，其降解效率较高，Mg2+和Cu2+可激活其降解效率，但Zn2+是强抑制剂，同时蛋白酶K、蛋白酶K加上SDS以及高温均可降低其降解效率。LIANG Z等［33］利用香豆素为碳源筛选出一株假单胞菌属，其对黄曲霉毒素B1的降解率达到85.7%，经硫酸铵提取的粗酶液对黄曲霉毒素也具有良好的降解效果。MOTOMURA M等［34］从糙皮侧耳中分离纯化一种酶，该酶分子质量约为90 ku，经薄层层析分析，该酶在pH 4.0～5.0和温度25℃时可有效降解黄曲霉毒素。此外，从真菌中分离的虫漆酶也可有效的去除黄曲霉毒素的毒性［35］。

4　黄曲霉毒素防治的发展趋势

黄曲霉毒素的研究目是对其进行有效防治，降低污染风险，保证人类健康。近些年，人们通过不断地研究和探索，已从各个学科领域获得黄曲霉毒素的相关信息。利用物理化学法去除黄曲霉毒素虽具有一定的效果，但可能会影响产品品质并带来其他副产物甚至毒性副产物产生，因此，未来关于黄曲霉毒素的防治主要集中在生物防治领域。首先，可利用基因工程技术将产毒相关基因敲除，使其丧失产毒能力并转化为不产毒菌株。其次，筛选出可抑制产毒菌株生长繁殖的微生物，使其与产毒菌株发生拮抗作用，降低黄曲霉毒素的污染。再次，筛选出优势菌株，具有明显降解黄曲霉毒素的能力，该菌株应具备：（1）毒素被破坏或者被转化成无毒化合物；（2）真菌孢子和菌丝体应被破坏，以避免有新的毒素产生；（3）处理对象应该保持它原有的营养水平和风味；（4）不明显改变原料的物理性状，且经济可行。

利用生物防治方法降低黄曲霉毒素污染虽然还有很长的路要走，但它为真菌毒素类的污染防治提供了一种具有前景的生物学策略，其关键是寻找高效、廉价的微生物及其制剂。

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Research advances of extraction，detection and prevention for aflatoxins

LI Conghu1，LIU Yiran1，LI Xiaochun1，XING Chaofeng1，WANG Zhiyong1，HUANG Xiaoping1，2
（1.College of Life Sciences，Anqing Normal University，Anqing 246011，China；2.College of Chemistry and Life Sciences，Quanzhou Normal University，Quanzhou 362000，China）

Aflatoxins are secondary metabolites mainly secreted byAspergillus flavusandAspergillus parasiticus，which are caicinogenic，teratogenic and mutagenic.They mainly harm liver，kidney and other organisms.Therefore，aflatoxins are very harmful to human.In this paper，the hazard，extraction and the detection of aflatoxins were discussed.Furthermore，the prevention method of aflatoxins was suggested to provide a reference for further strengthening aflatoxin control.

aflatoxins；detection；prevention

Q815

A

0254-5071（2015）10-0005-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.002

2015-09-13

国家青年自然科学基金项目（81502687）

李从虎（1987-），讲师，博士，研究方向为微生物及生物质资源化利用。