鸡源里默菌的分离和鉴定

刘发志，李占鸿，尹金花，苏敬良

（1.湖北三峡职业技术学院生物化工学院，湖北 宜昌443000 ；2.中国农业大学动物医学院农业部动物流行病学与人兽共患病重点实验室，北京 海淀100193）

里默菌为革兰阴性、无芽孢、多形态杆菌，属于黄杆菌科里默菌属，包括鸭疫里默菌（Riemerella anatipestifer）、鸽里默菌（R.columbina）和鸽咽里默菌（R.columbipharyngis），以及部分尚未完全能确定分类地位的分离株[1-3]。该属细菌主要分自于家禽和野生鸟类，其中，以鸭疫里默菌感染分布范围最广，特别是商品肉鸭的感染给我国水禽养殖造成巨大的经济损失。有关该属其他成员的报道逐渐增加，如从有呼吸道症状或外表健康的家养鸽子以及鸵鸟中分离到的鸽里默菌和鸽咽里默菌[4-5]。近期的研究发现早期从病鸡呼吸道分离的巴氏杆菌属的部分分离株与里默菌关系密切，但与本属已鉴定种存在一定的差异，并将其暂时归类为里默菌分类2 群（Riemerella-like taxon 1）。本试验自鸡呼吸道分离到1 株革兰阴性杆菌，经过分子生物学检测该菌株与里默菌分类2 群分离株高度同源。

1 材料与方法

1.1 细菌分离 病料为送检50 日龄死亡鸡，鸡群在送检期间有呼吸道症状鸡的数量呈上升趋势，剖检内部脏器未见有特征性的肉眼病变。完整剥离病鸡气管，在无菌工作台内用灭菌剪刀将气管中后段剪开，用灭菌缓冲液浸湿的棉拭子涂擦气管内壁采样并直接接种于含5%绵羊血的胰蛋白大豆琼脂（TSA）培养基上，在烛缸中37 ℃培养过夜。

1.2 细菌鉴定

1.2.1 形态学观察 挑选单个菌落在添加2%小牛血清的TSA 琼脂平板划线培养，经3 次连续传代纯化获得大小和形态基本一致的菌落后冻存，同时用接种环挑取细菌培养物涂布于载玻片上，火焰固定后进行革兰染色，在光学显微镜下观察细菌的形态。

1.2.2 16S rRNA 和rpoB 基因序列分析 将分离细菌接种于含2%血清的胰酶大豆肉汤（TSB）中，37 ℃摇振过夜，离心收集菌体，利用细菌DNA 纯化试剂盒提取细菌基因组DNA，以细菌16S rRNA 通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/1429R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和rpoB 基因通用引物（rpoBF：5′-GTTATCAACTCTTTCTTTGGTAC-3′/rpoBR：5′-GCATCATATTAGAACCCAT-3′）进行目的基因扩增，扩增产物经纯化后进行核酸序列测定，并与NCBI 数据库相关基因序列进行比对和分析。

1.3 细菌生长曲线测定 挑取纯化的单菌落，接种于含2%胎牛血清的TSB 培养基，37 ℃摇振培养16 h（200 r/min），获得种子液；用TSB 调节菌液OD600nm=0.1，吸取1 mL 菌液接种于200 mL TSB培养基中，37 ℃摇振培养16 h（200 r/min），每1 h取1 次样，利用分光光度计测样品OD600nm 值，绘制细菌生长曲线。

1.4 药敏试验 挑取纯化的单菌落，接种于含2%胎牛血清的TSB 培养基中，37 ℃，200 r/min 摇振培养过夜，调整细菌浓度至108CFU/mL 左右，均匀涂布于TSA 平板上，用无菌眼科镊子将药敏纸片轻轻贴于平板上，37 ℃培养24 h 后，测量抑菌圈直径。

1.5 致病性试验 将50 只5 日龄商品代北京鸭分成静脉注射组20 只，呼吸道感染组20 只，未感染对照组10 只，分别饲养于负压禽用隔离器中。静脉注射组每只静脉注射0.5 mL 新鲜菌液（4×109CFU），呼吸道感染组每只滴鼻感染0.2 mL 菌液（1.5×109CFU）。观察记录发病情况。分别于感染后1、3、7 d 每组各扑杀3 只，从血液、肝脏、肺脏和气管中进行细菌分离培养。

2 结果

2.1 细菌分离培养和形态特征 1 份50 日龄的鸡气管样品接种至在添加5%血液的TSA 平板培养24 h 后上生长有较为一致的直径1～2 mm、灰白色、表面隆起、光滑、湿润的菌落，菌体革兰染色为阴性短杆状。经纯化培养后，在TSB 培养基中生长良好。细菌接种至新鲜TSB 培养基中经过约4 h 适应后进入对数生长期，之后在接种后11 h进入稳定增长期。

2.2 菌株16S rRNA 和rpoB 基因序列测定及分析

采用PCR 技术对分离株16S rRNA 基因进行扩增获得预期的目的片段，序列分析结果获得1 158 nt 可读序列。比对分析结果显示，该分离株与鸭疫里默菌16S rRNA 基因的同源性为95.8%，与鸽咽里默菌模式菌8157 株16S rRNA 基因同源性为97.1%，而与里默菌第2 分类群（Riemerella-like taxon 2）的分离株IPDH359/90和IPDH98/90的同源性为98.7%。rpoB基因序列分析结果显示，该分离株与IPDH 359/90 株相应基因片段的同源性达100%，而与鸽咽里默菌相应片段的同源性为83%。进化分析结果进一步证明HB2013 株与该分类群处于同一分支中（图1）。综合16S rRNA 和rpoB 基因分析结果，将该分离株归类为里默菌第2 分类群，命名为里默菌HB2013 株（Riemerella sp.HB2013）。

2.3 药敏试验 纸片扩散法检测分离细菌对抗菌药物的敏感性结果发现，在试验所用的23 种抗菌药物中，该菌株对头孢哌酮、头孢哌酮/舒巴坦、大观霉素、头孢西丁、阿莫西林-克拉维酸、左氧氟沙星、利福平高度敏感；对青霉素、氨苄西林、新霉素、阿米卡星、卡那霉素、链霉素、红霉素、罗红霉素、头孢噻肟、头孢吡肟、克林霉素、万古霉素和四环素中度敏感；对诺氟沙星低度敏感；对阿奇霉素和磺胺甲噁唑不敏感。

2.4 致病性试验 经静脉注射和滴鼻两种途径感染5 日龄雏鸭与未感染对照组相比，在试验期内均未表现任何异常。滴鼻感染组在感染后24 h，仅在气管中分离到少量细菌；两个感染组在感染3 天后，在血液、肝脏、肺脏和气管中均未能分离到该细菌。

3 讨论

到目前为止，绝大多数里默菌分自鸭、鹅、火鸡或鸽，其他宿主来源则较少。我国里默菌感染主要见于水禽（鸭和鹅），是商品肉鸭和鹅最常见的细菌性传染病之一，但鸡源里默菌的分离在国内较为少见。本研究从鸡的气管中分离到里默菌HB2013 株的16S rRNA 基因与鸽咽里默菌，以及Christensen 和Bisgaard 报道[1]的里默菌第2 分类群菌株的同源性均高于97%，但rpoB 基因分析结果显示，HB2013 株与前者有显著地差异，与后者高度同源，因此我们将该菌株暂时鉴定为里默菌第2 分类群，其确切归类可能需要做进一步的表型和遗传学特征分析。虽然初步研究表明，该菌株对雏鸭没有明显的致病性，但其对鸡的感染有待进一步探讨。

[1] Christensen H，Bisgaard M.Phylogenetic relationships of Riemerella anatipestifer serovars and related taxa and an evaluation of specific PCR tests reported for R.anatipestifer [J].Journal of Applied Microbiology，2010，108：1612-1619.

[2] Rubbenstroth D，Martin Ryll M，Hotzel H，et al.Description of Riemerella columbipharyngis sp.nov，isolated from the pharynx of healthy domestic pigeons（Columba livia f.domestica），and emended descriptions of the genus Riemerella，Riemerella anatipestifer and Riemerella columbina [J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2013，63：280-287.

[3] Vancanneyt M，Vandamme P，Segers P，et al.Riemerella columbina sp.nov.a bacterium associated with respiratory disease in pigeons [J].International Journal of Systematic Bacteriology，1999，49:：289-295.

[4] RubbenstrothD，Hotzel H，Knobloch J，et al.Isolation and characterization of atypical Riemerella columbina strains from pigeons and their differentiation from Riemerella anatipestifer [J].Veterinary Microbiology，2011，147：103-112.

[5] Bocklisch H，Huhn F，Herold W，et al.Ostrich-A new avian host of Riemerella columbina [J].Veterinary Microbiology，2012，154（3-4）：429-431.