猪细小病毒基因组特性的研究

2015-01-25王正阳罗亚坤吕世明崔尚金

猪业科学 2015年4期

关键词：核苷酸细小毒株

王正阳，罗亚坤，吕世明，崔尚金*

（1.贵州大学动物科技学院药理实验室，贵州贵阳 550025；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150001）

猪细小病毒基因组特性的研究

王正阳1，2，罗亚坤2，吕世明1，崔尚金1，2*

（1.贵州大学动物科技学院药理实验室，贵州贵阳 550025；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150001）

猪细小病毒(PPV)属于细小病毒科细小病毒属的成员。猪细小病毒病是由PPV引起的以胚胎和胎儿感染及死亡而母体本身无明显症状的一种母猪繁殖障碍性传染病。1967年，Carteright等对猪的不孕、流产、死产等进行病原学研究时首次报道了本病，并从猪的流产胎儿中分离到PPV。目前，此病在世界范围内广泛流行，是造成母猪繁殖障碍的主要病因之一。

探究猪细小病毒的基因组特性对临床上防治该病毒的感染起到了至关重要的作用。最近30多年来，猪群中一直使用相同的灭活苗，但因PPV引起的母猪繁殖障碍仍时有报道，这突显了PPV分离检测的重要性，同时也提醒我们要考虑PPV的进化与变异问题。目前，随着国内外对猪细小病毒基因特性研究的日益深入，尽管PPV病毒一直存在一些氨基酸序列替换，但人们普遍认为PPV的核苷酸替代率低，接近于哺乳动物。然而，一些自主复制的细小病毒，包括犬细小病毒和人类的B19病毒，它们每年每个位置的核苷酸替代率大约为1 × 10-4，这与RNA病毒很相似。此外，近年来的研究表明，一些新型细小病毒首次分离并鉴定，例如在猪体内新分离出PPV2、PHoV(本文称PPV3)和PPV4等，但这些病毒对猪的危害尚不清楚。

针对这些问题，本文对PPV的基因组和核苷酸的替代、分子进化以及新型细小病毒的出现等进行了综述，以期为猪细小病毒的进一步研究与防治提供参考。

1 PPV基因组

细小病毒的基因组是长约4 500～5 500 bp的单链DNA分子。病毒序列的2个末端有1个复杂的回文发夹结构（类似于“Y”或“T”形），约120至200个碱基。这些结构可以作为病毒DNA复制过程中的引物，在保持病毒基因组完整性上可能起重要作用。在细小病毒基因组中有2个开放阅读框（ORF）：一个编码非结构蛋白，另一个编码结构蛋白。位于该基因组5'末端的ORF编码非结构蛋白1（NS1），也通过选择性剪接来编码非结构蛋白2和3（NS2和NS3）。 NS1蛋白具有解旋酶和切割酶的功能，负责病毒的复制和加工。在3'末端，一个小的ORF和大的ORF通过拼接来编码病毒结构蛋白1（VP1）；病毒结构蛋白2（VP2）是从相同的ORF转录得到的；病毒结构蛋白3（VP3）是VP2的酶促裂解产物，其酶切位点位于VP2转录起始点下游70 nt处的区域，该区域甘氨酸含量丰富。此外，复制过程中的一个辅助蛋白（SAT）是由另一个位于基因组中间靠近VP2起始密码子的小ORF编码的。

2 PPV基因组的转录

PPV整个基因组的转录由2个启动子指导：一个是P4，位于基因组的5’末端，启动非结构蛋白的转录；另一个是P40，位于该基因组中间，启动病毒结构蛋白和SAT蛋白的转录。早期启动子P4从基因组的225 nt处开始转录，晚期启动子P40从 2 035 nt处开始转录，产生PT4和PT40这2种原始转录产物，两者共同终止于4 833 nt处的poly(A)， PT4和PT40经过4种不同的拼接方式，产生4种次级转录物R1（4.7 kb），R2(3.3 kb)，R3(3.9 kb)和R4 （2.9 kb）。而后翻译成PPV的结构蛋白（VP）和非结构蛋白（NS）。

3 PPV基因组的编码蛋白

3.1 结构蛋白

结构蛋白是PPV的主要免疫原性抗原。PPV基因组编码了3种结构蛋白：VP1、VP2和VP3，它们的分子质量分别是83 ku、64 ku和60 ku。VP1和VP2的许多氨基酸序列是重叠的。VP1的N端有一脯氨酸丰富区，在病毒从细胞外转移到细胞内起重要作用。VP2是构成衣壳蛋白的主要成分，具有血凝活性，VP2基因编码的多肽能自我装配成类病毒粒子，是良好的抗原转运载体，能诱导强的细胞免疫。VP3是VP2的翻译后切割加工的产物，只在衣壳装配和病毒基因组包装后才出现。这3种病毒蛋白质一起组装形成二十面体的衣壳。不同的PPV毒株具有不同的致病性，其中结构蛋白可能发挥着重要的作用。通过非致病性毒株NADL2和毒力株Kresse之间基因组的比较，它们非编码区的基因组几乎相同。其非结构基因的氨基酸替换也都是相同的，8个能改变转录氨基酸的替换基因中，有6个位于结构基因（VP1/VP2）中，VP2氨基酸与野株相比，有5个氨基酸（I-215-T，D-378-G，H-383-Q，S-436-P和R-565-K）改变一致，其中D-378-G，H-383-Q和S-436-P的改变，是导致PPV不同的组织嗜性的原因之一。

3.2 非结构蛋白

PPV基因组编码3种非结构蛋白NS1、NS2和NS3，分子质量分别为75.5 ku、18.1 ku、12.4 ku。NS1具有解旋酶活性，可以改变PPV病毒末端的空间构型，是病毒DNA的复制所必需的。PPV病毒的复制依赖其末端的发夹结构，从特异位点解开末端结构区是起始和终止过程的先决条件，3’端序列引导DNA的合成，NS1蛋白具有内切酶活性和共价结合5’端序列的特性，能共价结合复制型DNA的5’末端并具有特异部位的解链活性。

4 PPV的遗传变异

研究表明一些细小病毒表现出较高替换率，接近于RNA病毒。在最近10到20年中PPV出现了较多的遗传变异和新表型。在1994至2000年，Soares等人从巴西分离到毒株，并对VP2基因的部分片段进行了分析，确定了至少18个不同的表型（至少1个氨基酸不同），并把它们划分到了2个进化群体。此外，在2001年和2002年，Zimmermann等人分离到毒株也检测到6个不同的表型，在系统发育上可能被分成2个群。此后，中国和罗马尼亚在对野毒株研究中也描述了几个新的表型。

4.1 核苷酸的替代

一般认为PPV的核苷酸替代率低，接近于哺乳动物，且PPV在进化上亦比较保守，不同毒株虽然致病能力不同，但同源性却很高，然而，近年来不断出现的PPV新表型，而传统的疫苗已经不能有效预防某些PPV感染，这似乎表明PPV基因组出现了变异。为确认PPV新的基因突变，André等人对从奥地利、巴西、德国和瑞士近期分离的毒株进行了分析。对这些毒株的VP2基因的序列分析表明，在32个位点上发生了核苷酸替换，其中17个替换是同义的，15个替换是非同义的。在PPV全基因组的3889号核苷酸到4239号核苷酸之间被认为是高度变异的区域，却发现了3个同义替换和5个非同义替换，定义了2个守恒区（无核苷酸替换）一个在核苷酸3 507～3 718 bp之间，一个在 4 251～4 425 bp之间。对NS1基因的分析，发现44个位点有核苷酸替换。27个替换是同义的，17个替换是非同义的。确定了4个守恒区（无核苷酸替换），分别位于位点568～781 bp、847～1 022 bp、1 072～1 362 bp以及1 504～1 793 bp之间。在蛋白质水平上，保守区位于结构基因翻译的83～225氨基酸和437～579氨基酸之间。同时发现了2个可变区：位于226～233和365～436号氨基酸之间，也发现了3个非结构基因的保守区（无氨基酸替换），分别位于83～163，165～357和368～561号氨基酸之间。并且在该基因的末端562～658氨基酸之间，发现了一个具有更高变异性的区域。

4.2 PPV的进化分析和选择压力

有关PPV新表型的报道表明，PPV新表型的衣壳表面的氨基酸发生了改变。这些氨基酸的替换可能引起病毒不同的致病性。研究表明大部分PPV疫苗株的抗体对于这些新表型的中和活性较低。因此，Zeeuw等人提出这样一个假说：疫苗可能给PPV野毒株造成选择压力而导致“逃避突变体”。

然而，在野猪种群中的PPV基因型比家猪更多样化，每年野猪的氨基酸替换率明显高于研究中的家猪样品的替换率。这与疫苗给PPV野毒株造成选择压力而导致其变异和遗传多样性增多这一结论似乎不相符，并且André等人的研究表明培养的同种病毒在有抗体压力下比在没有抗体压力下，核苷酸和氨基酸的替换更少，尤其是在有同源抗体压力的毒株中表现的特别明显。在体外模型中研究中，发现有抗体存在的情况下遗传多样性更低。在强大的抗体选择压力下，PPV多数变异都是有害的，由此推测对PPV来说似乎抗体的中和选择比适应进化更重要，而不是疫苗的使用导致PPV变异和进化，因此推动细小病毒进化的选择力量仍然不确定。

对于PPV进化树和年代分析，André等人的研究表明，VP1全基因的贝叶斯最大进化支生成的可信度树显示了2个不同的进化支和2个簇，基于VP1部分基因的序列也确定了另外2个进化支和另外1个簇。在NS基因进化树中，几乎所有的序列都具有独特的进化树，只有2个簇与VP1进化树是一致的。对NS和VP1数据集的年代分析表现出2种截然不同的时间周期。结构基因中这2个数据集的主要分歧出现在过去30年，非结构数据集分歧则在10至125年前的一段时间形成，主要集中在过去的30～60年。

选择性压力和进化速率表现出相似的水平。崔尚金等人发现PPV大多数的变化是在高选择压力下观察到的，研究发现不同的病毒或基因中的选择压力和替换率之间有明显的相关性。在André等人的研究中，每个位点dN/dS替代的平均速率表明，NS1和VP1基因在进行进化选择，根据测试的模型，证实压力顺序为部分VP1 ＞全VP1＞全NS1。而在PPV的进化速率中，结构基因的进化速率亦是高于非结构基因。