干细胞移植治疗脑缺血的研究进展

干细胞移植治疗脑缺血的研究进展

高海军刘朋飞金明月1牟青春2黄海燕

(吉林大学第一医院神经肿瘤外科，吉林长春130021)

关键词〔〕干细胞移植；脑缺血

中图分类号〔〕R743.31〔文献标识码〕A〔

通讯作者：黄海燕(1963-)，男，副教授，博士生导师，主要从事颅内肿瘤的诊断治疗和胶质瘤的光动力和内放射治疗及脊髓及先天性疾病显微外科治疗研究。

1吉林大学第一医院儿科超声室

2牡丹江医学院红旗医院神经外科

第一作者：高海军(1987-)，男，硕士在读，主要从事颅脑相关肿瘤研究。

缺血性脑卒中是老年人致死致残的主要疾病，且发病有逐年上升趋势〔1〕。干细胞具有自我更新并分化为多种细胞系的能力〔2〕。在体外实验中诱导型多能干细胞(iPS)可以来自成人的正常细胞，并分化成为特定类型的神经细胞。有报道〔3，4〕指出脑缺血大鼠在干细胞移植治疗后继发了肿瘤形成。iPS诱导肿瘤形成的可能，限制了这一治疗的临床应用。在体外实验中，胚胎干细胞(ESCs)具有分化为人体所有类型细胞的能力，并且可以无限制的自我更新。人类ESCs是多能分化的，并且可以从5d大的人类囊胚中获得。然而由于伦理问题和导致肿瘤生成的风险〔5〕，ESCs移植的临床试验评估并不乐观。除了诱导型多能干细胞和ESCs，成人干细胞是PS并可以从多种渠道获得。成人干细胞移植的优点是其适用于自体和同种异体移植。目前，成人干细胞治疗缺血性脑卒中可以分为内源性和外源性两种。前者是应用内源性干细胞；后者与外源性的干细胞移植有关。然而，成人干细胞移植和iPSCs及ESCs相比在分化潜能上并没有优势。

1内源性干细胞移植

1.1神经干细胞(NSCs)在成人中枢神经系统的一些区域存在内源性NSCs，主要分布于青壮年海马和室管膜下区(SVZ)，但这些内源性NSCs处于休眠状态。脑缺血促进了海马和室管膜下区细胞增殖和神经母细胞的形成，从而促进内源性NSCs迁移至缺血区域并分化为神经元整合到受损区域发挥作用〔6〕。脑缺血后在海马和室管膜下区都观察到了NSCs的增殖和分化增强。最近研究表明，刺激内源性神经细胞生成可以促进脑卒中后大鼠神经功能的恢复〔7〕，但由内源性NSCs产生的神经元数量极低，这与缺血环境不适合新生的神经元生存有关。这些新生的神经细胞大多数死亡或者分化为胶质细胞。因此，刺激成人内源性NSCs对于缺血性脑卒中患者神经功能恢复的作用是有限的。

1.2造血干细胞(HSCs)另一种内源性干细胞疗法是使用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，一种作用于HSCs的生长因子。G-CSF是一种调节原始中性粒细胞增殖和分化的糖蛋白。在大鼠脑缺血模型中，G-CSF通过促进内源性神经细胞生成发挥神经保护作用和神经再生的作用，从而减小缺血面积，改善行为，促进感觉运动功能恢复〔8〕。但G-CSF对HSCs的作用是否适用于人类尚不清楚。事实上，受缺血环境的影响，内源性HSCs存活增殖和分化的可能性很小。因此，通过内源性干细胞难以完成缺血后脑组织损伤修复。

2外源性干细胞移植

2.1ESCs具有无限制的自我复制和多潜在的多种分化能力，来源于胚泡早期的囊胚内细胞群，具有在特殊条件下分化成机体NSCs多种干细胞的潜能，使得ESCs成为进行细胞移植最为理想的细胞来源〔9,10〕。机体内ESCs首先由Evans等〔11〕从小鼠囊胚分离获得,而体外ESCs则由Thomson等〔12〕从冷冻的体外受精多余囊胚中分离获得。研究发现在发育和成熟的中枢神经系统中均存在着NSCs〔13〕，目前通过采用ESCs移植的动物的大量实验显示ESCs源性的神经元细胞移植入动物后，可以和动物的大脑吻合在一起〔14〕，这为临床上脑缺血的细胞替代治疗提供了一种理想的细胞。目前利用ESCs诱导分化NSCs较公认的方法是：利用碱性成纤维细胞生长因子谱系选择法。其中碱性成纤维细胞生长因子是早期神经前体细胞生存、增殖的重要因子，这一方法由Okabe等〔15〕所建立，通过该诱导方法得到的神经元细胞，倾向于中脑、后脑部位的神经元。虽然取得了很大的突破，但是ESCs在临床上应用于治疗神经系统疾病还是存在很大问题，如安全性、细胞系在体外的保存、移植后排斥反应、致畸性及伦理、法律问题〔5〕，上述情况均限制了ESCs移植在脑缺血治疗方面的发展。

2.2NSCs外源性的NSCs多来源于胚胎或胎儿。关于动物模型的研究表明移植后的NSCs可以生存、增殖、分化为神经细胞，并移行至缺血区域发挥神经保护作用〔16〕。而且外源性NSCs在促进缺血性脑卒中患者功能恢复的同时不会引起肿瘤形成〔17〕。人NSCs可从婴儿纹状体和大脑皮质中分离而来。将人NSCs植入脑缺血的大鼠脑内，NSCs可移行至缺血区域，增殖分化为神经元，并改善感觉运动功能〔17〕。有人研究发现将NSCs移植入脑缺血大鼠脑内，能明显修复缺血性脑损伤。然而，存活并分化为神经元的NSCs很少，这些细胞要么死亡要么停止分化〔18〕。NSCs的另一个缺点是从患者体内分离出的NSCs在临床应用方面不具可行性。由于人NSCs的神经营养作用及其较小的致肿瘤生成的风险，在过去的10年中它被广泛应用于临床前期脑缺血的研究。最近一个由英国公司发起的临床试验，结果显示，所有进行移植的患者均未发生移植相关不良反应。临床试验发现患者的感觉运动功能在移植人NSCs6～12w后有所改善〔19〕，这表明对缺血性脑卒中患者进行NSCs移植是安全可行的。

2.3间充质干细胞(MSCs)MSCs具有分化为神经细胞包括神经元和神经胶质细胞的能力。关于动物脑缺血模型的研究表明MSCs移植能显著促进神经功能恢复。这种功能恢复主要是由于这些细胞可以分泌大量的细胞因子和生长因子如血管内皮生长因子(VEGF)，参与血管生成，愈合及组织修复过程〔20〕。人类MSCs可来源于成人骨髓、外周血、脐带血及脂肪组织，它们可以分化为多种组织如骨、软骨及脂肪组织等。骨髓MSCs能在脑缺血大鼠体内通过下调细胞凋亡蛋白酶3基因的表达，从而抑制脑缺血后神经细胞凋亡。Honmou等〔21〕用自体人MSCs移植第一次评估了干细胞治疗缺血性脑卒中的可行性与安全性。对这些患者5年的随访并没有发现不良反应，但功能恢复也不是很明显。人MSCs可以对灰质或白质或两者都产生显著作用〔22〕，MRI检查显示脑梗死面积在移植后1w减少了20%。临床研究表明hMSCs能促进脑缺血患者功能恢复，而且没有副反应。由于rMSCs能从自体器官获得，因而移植后无需进行免疫抑制治疗，这是其主要优点。人MSCs不会引起伦理方面的争议。MSCs易获得和增殖，并能定向迁移至受损脑组织，分泌细胞因子和生长因子，调节炎性反应〔23〕。

2.4HSCs(CD34+) 另一种可用于移植的PS为HSCs。同样，有大量将HSCs移植用于脑缺血患者治疗的研究。临床前研究已经表明HSCs移植对脑缺血大鼠具有明显的作用。其中一些研究已经证实在大鼠脑缺血后48 h移植HSCs(CD34+)，大鼠脑缺血半暗带区血管生成增加，随后神经再生增加。这种血管再生能调节脑缺血后神经重塑和神经再生〔24〕。研究表明，在脑缺血后1w的大鼠颅内直接移植HSCs(CD34+)能提高大鼠神经和血管再生。这些移植的细胞还能够分化为神经细胞、神经胶质细胞及血管内皮细胞。人脐带血可以是HSCs的来源，但实际能获得的HSCs很少。骨髓为自体HSCs移植提供了最佳选择，尽管获取过程比较痛苦〔25〕。目前，HSCs移植已用于临床实验如脑缺血的治疗，脑缺血的实验模型已经表明其具有提高神经保护和再生的作用〔26〕。人HSCs在维持体内稳态和修复神经系统损伤方面具有重要作用。HSCs的优点在于它适用于自体细胞移植也适用于同种异体移植，而且也不会引起伦理方面的问题。缺点是其与从骨髓中获得的细胞数量和分化的一致性有关，尤其对于老年患者。不同来源的HSCs(CD34+)移植的安全性与可行性仍处于临床试验当中。

2.5骨髓单核细胞(BMMNCs)BMMNCs包括间充质和HSCs。它们易于从骨髓获得并且适用于自体及同种异体移植。在脑缺血动物模型中BMMNCs被发现可以改善神经功能缺陷并减小脑缺血面积〔27〕。BMMNCs的优点是其易于从骨髓获得，这使其更适用于临床应用。很多临床实验表明BMMBCs已经应用于慢性脑缺血的病人〔28〕。经过6个月的随访，并没有发现与治疗有关的不良反应。所有的患者在移植后2h都可以发现细胞迁移。

3脑缺血的干细胞疗法(SCT)

3.1SCT的时间选择干细胞移植治疗缺血性脑卒中的最佳移植时间取决于治疗目的。如果治疗目标是获得神经保护作用，则急性期移植是可取的。如果治疗目标是为了促进内源修复和抑制神经细胞凋亡，则急性或亚急性治疗是必要的。动物实验研究表明，在脑缺血后24h和72h进行BMMNCs移植，神经功能得到显著改善;而脑缺血后7d后进行注射则没有明显效果〔29〕。目前，最佳治疗时间尚需进一步研究。

3.2SCT的剂量大剂量的干细胞可能会增加潜在风险，如增加肿瘤形成和动脉内注射形成血栓的风险等。因此，临床前研究仍须对移植细胞数量相关毒性进行评估。

3.3SCT的移植途径在临床研究和临床前实验研究中有几个移植途径。立体定向颅內移植能将干细胞直接注入受损区域，这一路径效果更好。但此路径为有创性操作，并且可能破坏邻近脑组织。另一方面，动脉内注射可能导致很高的死亡率〔30〕。静脉内注射最简单最安全，为非侵入性过程，但可能使干细胞向非耙器官聚集，如肺、肝及脾等，使得脑内缺血区干细胞不足〔31〕。移植途径必须考虑有效性与安全性的问题。目前，移植的最佳路径尚未确定。

3.4细胞追踪非侵入性的影像学手段对于评估缺血区域非常重要。追踪干细胞并监测干细胞的存活、迁移及对大脑功能的影响。在目前的临床前期研究中，其中一种追踪方法是应用超顺磁氧化铁颗粒(SPIO)标记细胞的方法。此外，磁共振成像(MRI)、生物发光成像(BLI)、PET、SPECT也能用于对体内移植的干细胞进行追踪。最近一项研究证实PET能用于测量内源性NSCs在体内的活化情况，尤其是脑缺血后SVZ区的情况。然而，如果干细胞与标志物发生分离，追踪则会失败或是导致追踪信号极度减弱。另外，如果干细胞死亡或被巨噬细胞吞噬，获得的信号就会具有误导性。一些纳米粒子如PVBM涂层γ-Fe2O3的纳米颗粒和荧光量子点已经被证实没有细胞毒性，并且干细胞标记在动物模型中很有效。纳米粒子为干细胞移植研究带来了光明的前景，尤其对于体内细胞追踪，这对干细胞治疗研究的几个障碍产生了重要影响。

4小结

对大鼠脑缺血模型的研究使脑缺血病人的干细胞移植治疗充满前景。这一治疗通过调节多种机制发挥作用，可能涉及新的神经通路形成，抑制细胞凋亡和炎症反应，促进血管和神经再生，这与内源性修复一致。目前，大量临床试验已经证实了不同途径干细胞疗法的有效性、安全性和可行性。然而何种来源的干细胞(hNSCs、hMSCs、HSCs等)最适用于治疗缺血性脑卒中尚不清楚。此外，在动物模型中干细胞移植后的生物学行为改变不能完全反映这些细胞在患者体内是如何活动的。而且动物模型不能完全模拟脑缺血患者各方面的病理情况。总之，干细胞移植的临床应用还面对诸多挑战，仍需进一步研究。但无疑，干细胞移植将为未来治疗脑缺血提供新的方法。

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〔2015-04-25修回〕

(编辑曲莉/滕欣航)