肠道病毒EV71新型VLPs疫苗的制备及鉴定

董 轲，王 希，龙 敏，王 琳，张惠中

(第四军医大学唐都医院 临床实验与检验科，陕西 西安 710000)

肠道病毒EV71新型VLPs疫苗的制备及鉴定

董 轲，王 希，龙 敏，王 琳，张惠中

(第四军医大学唐都医院 临床实验与检验科，陕西 西安 710000)

目的 制备肠道病毒71型(EV71)的新型病毒样颗粒(VLPs)疫苗，为手足口病防治奠定基础。方法 应用分子克隆技术构建外壳蛋白VP1融合基因cVP1，免疫细胞化学及Western Blot测定该融合基因在HeLa细胞表达情况；将cVP1克隆于杆状病毒表达载体pFastbac1，应用昆虫细胞TN5制备重组杆状病毒cVP1 rBV，再将此重组病毒与本室保存的gag rBV以不同MOI比例共感染昆虫细胞TN5，得到含有VP1的重组嵌合病毒样颗粒cVP1 VLPs，最后以Western Blot及电镜进行鉴定。结果 免疫细胞化学及Western Blot结果显示构建的融合基因cVP1可在真核细胞内表达，并成功制备成cVP1 rBV，该重组杆状病毒和gag rBV共感染昆虫细胞制备的VLPs结构完整。结论 成功制备了EV71的新型VLPs疫苗，为后续研究打下了基础。

手足口病；肠道病毒71型；病毒样颗粒；制备及鉴定

手足口病(hand, foot and mouse disease，HFMD)为一组肠道病毒引起的传染性疾病，近年来在我国持续爆发，严重危害公众健康并带来巨大社会负担。引发手足口病的肠道病毒包括A组柯萨奇病毒、埃可病毒和肠道病毒71型等，其中肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)病毒感染是部分患者出现中枢神经系统、呼吸系统和循环系统严重并发症并导致死亡的重要原因[1-2]。因此，应用新的技术手段及策略，研发安全性更高、免疫保护性更强并利于产业化生产的新型手足口病疫苗具有重要的理论及实际应用意义。Foo等(2007年)研究显示，EV71病毒抗原表位基本位于外壳蛋白VP1、VP2上，尤其VP1壳蛋白不仅与病毒的抗原性密切相关，而且还包含了病毒特异性中和表位，因此多种EV71疫苗的研究均以VP1为靶点。

病毒样颗粒(virus like particles，VLPs)是某些病毒的结构蛋白在细胞内自行装配成无核酸成分的病毒样粒子，因不含病毒核酸成分(无感染性)、与野生型病毒壳蛋白空间结构高度相似(高免疫原性)等特点，近年来已成为疫苗研发的热点之一。SIV gag基因编码的蛋白可自我装配成核心颗粒，以出芽方式分泌到细胞外时获得包膜及膜蛋白。研究表明，可利用gag的此特性将外源性的跨膜蛋白锚定在gag的包膜上获得嵌合型VLPs[3]。本课题拟借助逆转录病毒gp41及gag蛋白结构及作用关系特点，构建新型EV71-VLPs疫苗，为EV71病毒的新型VLPs疫苗研发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

含EV71-P1基因的重组质粒EV71-P1-TV由本室构建并保存；env-sf162-PCAGGs、SIV-gag-PCAGGs及重组杆状病毒rBV gag均由美国EMORY大学Chinglai Yang教授馈赠；E.coli DH10Bac感受态细胞、Cellfectin、S.N.A.P MidiPrep Kit均购自Invitrogen公司；昆虫细胞TN5、子宫颈癌细胞系HeLa均为本室保存；昆虫细胞培养基SF900Ⅱ购自Gibco公司；T DNA Ligase、Taq DNA聚合酶为TaKaRa公司产品；胎牛血清FBS购自Hyclone公司；HRP标记羊抗鼠IgG和TCL发光剂购自Pierce公司。鼠源Gag抗体购自Abcam公司，EV71 VP1抗体购自Abnova公司。

1.2 方法

1.2.1 cVP1融合基因构建

应用PCR方法，以env-sf162-PCAGGs为模板获得gp41的信号肽、跨膜区及胞内区基因片段，以EV71-P1-TV为模板获得EV71病毒基因VP1区。进而应用重叠PCR构建包括gp41的信号肽区、EV71 VP1、gp41的跨膜区(TM)和胞内区(CT)的融合基因，如图1所示，命名为cVP1，并克隆入真核表达载体PCAGGs中，获得真核表达载体cVP1-PCAGGs。

图1 cVP1结构示意图

Fig.1 Structure diagram of cVP1

1.2.2 Western Blot鉴定cVP1表达

培养HeLa细胞，应用Lipofectamine 2000TM转染上述构建好的真核表达载体，裂解细胞，测定蛋白浓度，行SDS凝胶电泳；应用半干法转膜，5% BSA封闭液封闭后，加入相应的VP1抗体，4℃孵育过夜，充分洗涤后，加入HRP标记的二抗，孵育1～2h后，充分洗涤，加Pierce ECL底物曝光。

1.2.3 组织化学染色鉴定融合蛋白表达

培养HeLa细胞，利用Lipofectamine 2000TM转染上述的真核表达载体cVP1-PCAGGs，并设置PCAGGs空载体为对照，制备细胞爬片，应用4%多聚甲醛固定，H2O2灭活内源性过氧化物酶后，滴加5% BSA封闭液封闭，加入VP1抗体，4℃过夜，洗片后加HRP标记的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)，37℃反应30min，洗涤后DAB显色。显微镜观察。

1.2.4 cVP1杆状病毒rBV cVP1的制备

将上述构建好的嵌合蛋白cVP1基因克隆于pFastBac1载体中，转化DH10Bac 感受态细胞，铺板(培养板含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素、以及100μg/mL Bluo-gal和40ug/mL IPTG)，挑取白色菌落，应用S.N.A.P MidiPrep Kit试剂盒提取、纯化重组杆粒DNA，应用Cellfectin试剂转染昆虫细胞TN5(具体方法参照试剂说明书)。28℃培养，每天观察细胞病变情况，5～6d后，6 000rpm 4℃离心30min，收集细胞培养上清。

1.2.5 cVP1病毒样颗粒的制备及鉴定

将rBV cVP1与rBV gag以不同MOI比例感染TN5细胞；至病变细胞数>90%(感染后约72h)，收集全部细胞混悬液，6 000rpm 4℃离心30min，留取上清，Western Blot鉴定。磷钨酸负染后，透射电镜观察制备好的VLPs形态结构。

2 实验结果

2.1 融合蛋白cVP1表达鉴定

将构建好的cVP1-PCAGGs表达载体转染Hela细胞，应用VP1抗体作为一抗进行Western Blot检测，结果如图2A所示，得到大小约为55kDa条带，与预期大小相符，而空载体PCAGGs转染未见目的条带，说明该融合蛋白可在真核细胞中表达。同时我们应用免疫细胞化学方法检测了cVP1-PCAGGs在HeLa细胞中的表达，结果如图2B显示，与空载体对照相比，该cVP1融合蛋白在HeLa细胞中高表达。

2.2 融合蛋白cVP1重组杆状病毒rBV cVP1的获得

将构建好的嵌合蛋白cVP1基因克隆于pFastBac1载体中，转化DH10Bac感受态细胞，获得重组杆粒DNA，应用Cellfectin试剂转染昆虫细胞TN5后，28℃培养，每天观察细胞病变情况，与正常细胞对照比较，转染重组杆粒DNA的TN5细胞逐渐增大、肿胀，渐脱离贴壁培养状态，如图3所示。收集细胞培养上清，即含重组病毒rBV cVP1。

2.3 融合蛋白cVP1病毒样颗粒疫苗的获得

将rBV cVP1与rBV gag以不同MOI比例共感染TN5细胞，至病变细胞数﹥90%(感染后约72 h)，收集全部细胞混悬液，离心后留取上清，行Western Blot鉴定，结果如图4，VP1抗体及gag抗体均检测到特异性条带，其中以6:1、10:1比例感染的TN5细胞上清，能够检测到较高浓度的cVP1和gag。

2.4 电镜鉴定融合蛋白cVP1病毒样颗粒形态

用磷钨酸负染后，透射电镜观察制备好的cVP1 VLPs形态结构表明，视野中出现结构完整的病毒样颗粒，其直径大小为100～110nm 与gag病毒样颗粒直径大小相似(直径大小约110nm)，结果如图5所示。表明本实验设计的分泌型VLPs制备方式能产生结构完整的病毒样颗粒。

3 讨论

3.1 融合蛋白cVP1的构建

肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picorna￣radae)的肠道病毒属(Enterovirus)，归属于人类肠道病毒A。该病毒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径约24～30 nm，核酸为单股正链RNA，由7400多个核苷酸组成，自5'端依次排列着5′非编码区、1个开放阅读框、3′非编码区以及多聚腺苷酸尾。在病毒复制过程中，病毒RNA首先翻译出一条完整长肽，进而被自身蛋白酶识别并切割为P1、P2、P3等3条多肽；其中P1被再次酶解为VP4、VP2、VP3及VP1等4个结构蛋白；在完整的病毒颗粒中，VP1、VP2及VP3结构蛋白位于病毒的外壳表面，VP4结构蛋白则位于内侧。研究表明，EV71病毒抗原表位基本位于壳蛋白VP1，VP2上[4-5]，因此本课题选择VP1作为疫苗抗原研究靶点。gp41是SIV病毒包膜蛋白的一个亚单位，一般以三聚体形式存在，结构分为膜外区，跨膜区和胞质区，在本课题中，我们应用gp41的信号肽、跨膜区和胞内区与EV71的VP1构建融合基因cVP1，此融合基因可在真核细胞中高表达，并可定位于细胞膜表面，为后续研究打下了坚实基础。

3.2 融合蛋白cVP1病毒样颗粒疫苗的获得及鉴定

早在1975年，保加利亚科学家就以氢氧化铝为佐剂，福尔马林灭活EV71病毒疫苗进行了初步临床试验。在随后的研究中，尤其近年来，随着人们对手足口病毒进一步认识，不同实验室尝试了各种不同的针对该疾病的疫苗制备方法，包括灭活全病毒疫苗、减毒活疫苗、亚病毒颗粒及DNA疫苗等[6-7]，且取得了巨大进展，但为了探索更安全、制备更简便的EV71疫苗制备方法仍需大量研究要做。SIV病毒gag基因编码的蛋白可被蛋白水解酶裂解成3个结构蛋白，分别为基质(MA)、衣壳蛋白(CA)及核衣壳蛋白(NC)，可自我装配成核心颗粒，以出芽方式分泌到细胞外时获得包膜及膜蛋白，在本实验中，应用昆虫表达系统同时在昆虫细胞内表达cVP1和gag蛋白，gag蛋白在自我组装并出芽到胞外时，会与包膜上的cVP1融合蛋白形成嵌合型VLPs。该方法利用了gag蛋白出芽分泌特点，因此制备疫苗时不需裂解细胞，仅仅收集细胞培养上清即可获得VLPs，为以后扩大化生产并产业化奠定了基础，也为其他新型VLPs疫苗的研究提供了平台。本课题在后续研究中，应进一步分析该疫苗的免疫原性，为动物实验打下坚实基础。

[1]李静,魏兴家,余永生.武汉阳逻地区2008至2012年手足口病流行特征分析[J].中国妇幼健康研究,2015,26(2):188-190.

[2]刘小乖,刘黎明.EV71的流行病学现状及研究进展[J].中国妇幼健康研究,2012,23(5):681-684.

[3]Ye L, Wen Z, Dong K,etal. Induction of HIV neutralizing antibodies against the MPER of the HIV envelope protein by HA/gp41 chimeric protein-based DNA and VLP vaccines[J]. PLoS One,2011,6(5):e14813.

[4]Yang S L, Chou Y T, Wu C N,etal.Annexin II binds to capsid protein VP1 of enterovirus 71 and enhances viral infectivity[J]. J Virol,2011,85(22):11809-11820.

[5]Lim X F, Jia Q, Khong W X,etal.Characterization of an Isotype-Dependent Monoclonal Antibody against Linear Neutralizing Epitope Effective for Prophylaxis of Enterovirus 71 Infection[J]. PLoS One,2012,7(1):e29751.

[6]Shao J, Zhang J, Wu X,etal.Comparing the Primary and Recall Immune Response Induced by a New EV71 Vaccine Using Systems Biology Approaches[J]. PLoS One,2015,10(10):e0140515.

[7]Li L, Yin H, An Z,etal. Considerations for developing an immunization strategy with enterovirus 71 vaccine[J]. Vaccine,2015,33(9):1107-1112.

[专业责任编辑：王宝西]

坚持哺乳可预防母婴糖尿病发病

来自加拿大的一项最新研究发现，进行母乳喂养能够帮助降低母亲以及孩子患糖尿病的风险。最近，来自加拿大Manitoba大学的研究团队找到了母乳喂养与Ⅱ型糖尿病发病率之间的关系。他们在24年时间里总共研究了来自Manitoba地区的334 553位孕产妇，其中有60 088位是生活在这一“孕期糖尿病”发病率超高地区的本地人，相比于来自外地的孕妇，她们的孕期糖尿病发病率高达2～3倍。而众所周知的事实是，孕期糖尿病症状很有可能会引发母亲与后代子女的Ⅱ型糖尿病。通过统计分析，她们发现本地的孕妇母乳喂养比例为56%，而外地孕妇母乳喂养的比例可达到83%。

那么如何才能降低糖尿病的发病风险呢？研究者们指出，坚持母乳喂养能够伴随下列结果的发生：对于本地母亲来说，能够降低14%患Ⅱ型糖尿病的几率；对于非本地女性来说，能够降低23%的患糖尿病几率；对于孩子来说(不论是否本地人)，都将降低18%患糖尿病的风险。这一结果与其它因素，包括：孕期糖尿病、孕期高血压、家庭收入、居住地、孕妇年龄以及婴儿体重等都没有相关性。

新的证据表明，坚持母乳喂养有益于预防糖尿病的发生。

Preparation and identification of novel VLPs vaccine against Enterovirus 71

DONG Ke, WANG Xi, LONG Min, WANG Lin, ZHANG Hui-zhong

(DepartmentofMedicalLaboratoryandResearchCenter,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710000,China；)

Objective To prepare a novel VLPs vaccine against Enterovirus 71 (EV71), so as to lay foundation for treatment of hand, foot and mouth disease (HFMD). Methods Molecular cloning methods was used to construct cVP1 gene, and the fusion gene expression in HeLa cells was tested using immunocytochemistry and Western Blot. Then cVP1 was cloned into pFastbac1 vector, and cVP1 recombinant baculovirus (cVP1 rBV) was obtained using insect cells TN5. After that cVP1 rBV and gag rBV were co-infected into insect cell TN5 in varied MOI ratios to gain cVP1 virus like particles (VLPs) with VP1 protein. These novel VLPs were identified by Western Blot and electron microscope. Results Immunocytochemistry and Western Blot results showed that cVP1 gene could be expressed in eukaryotic cells, and cVP1 VLPs were obtained by insect cells co-infected with cVP1 rBV and gag rBV. These novel VLPs had complete structure. Conclusion Novel VLPs vaccine based on EV71 are constructed successfully, which lays foundation for the following study.

hand, foot and mouse disease (HFMD); Enterovirus 71 (EV71); virus like particles (VLPs); preparation and identification

2015-11-04

国家自然科学基金资助项目(No.81572974)；陕西省自然科学基础研究计划资助项目(No.2013Jz010)

董 轲(1971-)，男，副教授，博士，主要从事疫苗的研究。

张惠中，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.06.006

R512.5

A

1673-5293(2015)06-1125-03