不同HPVDNA检测方法在子宫颈肿瘤诊断中的应用研究与进展

王 萍，贾小文

(1.陕西中医药大学第二临床医学院，陕西 咸阳712046；2.西电集团医院，陕西 西安 710077)

【妇幼综合研究】

不同HPVDNA检测方法在子宫颈肿瘤诊断中的应用研究与进展

王 萍1,2，贾小文2

(1.陕西中医药大学第二临床医学院，陕西 咸阳712046；2.西电集团医院，陕西 西安 710077)

人乳头瘤病毒(HPV) 感染是子宫颈上皮内瘤变(CIN)及子宫颈癌的主要致病因素，并且因HPV型别的不同，其致病能力也有差别，而持续感染高危型HPV则是促使子宫颈癌发生的最主要因素。近年来，随着宫颈癌普查技术的不断改进和提高，越来越多的早期宫颈癌被及时发现与其中HPV DNA检测技术的发展密切相关。该文对比分析目前常用的几种方法如实时荧光聚合酶链反应(PCR)法、基因芯片法、杂交捕获法(HC-Ⅱ)、高危型人乳头状瘤病毒DNA(酶切信号放大法)(HR-HPV)检测法、Cobas HPV检测，以期更好地服务临床。

人乳头瘤病毒；子宫颈上皮内瘤变；子宫颈癌；DNA检测

子宫颈肿瘤包括良性肿瘤和恶性肿瘤，其中子宫颈癌(cervical cancer)，起源为子宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)，发病率居妇科恶性肿瘤之首，且近年来呈迅速上升趋势[1]。从宫颈癌前病变进展为宫颈癌，大约需要10年左右的时间，而高危性人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染被确认为CIN和宫颈癌共同的致病因素，将HPV感染检测作为子宫颈癌及其癌前病变的常规筛查手段就成为了预防和控制宫颈癌发生发展的关键[2]，临床中高达99.7%的宫颈癌患者可检测出HPVDNA[3]。

1 人乳头瘤病毒的特性

HPV是一种含有遗传信息的闭合环状双链DNA，其核心为以共价键组成的约7 800～7 900个碱基对，由72个壳粒包被形成20面体；直径约55mm，分子量约5.4kD，无外膜包被，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，所有开放读码框均位于同一条DNA链上，此DNA链基本可分为3个基因区：早期蛋白编码区、晚期蛋白编码区及上游调控区。HPV有多种基因型，目前已分离出约130个型别，其中约35种与生殖道感染有关，约20种与肿瘤有关；不同的型别可引起不同的临床表现，根据感染侵犯的组织部位不同分为：皮肤型和黏膜型；根据 HPV 对细胞的转化能力分为高危型(如HPV16、18、31、33、35、39)和低危型(如HPV6、11、42、43、44)，前者与子宫颈癌及子宫颈上皮内瘤变相关，后者则主要与轻度鳞状上皮损伤和泌尿生殖系统疣等相关。

2 人乳头瘤病毒感染与子宫颈癌及其癌前病变的关系

HPV 感染可通过性生活传播，好发于性生活跃人群。已有流行病学和生物学证据表明，HPV感染是引起CIN及子宫颈癌的重要因素，且HPV负荷量高者宫颈发生病变的可能性更大。但并非所有感染了HPV的女性都发展成为宫颈癌患者，大多HPV感染呈现“一过性”，机体自身的免疫力大多可在2年内将 HPV 病毒清除。只有当HPV呈持续性感染时才是致子宫颈癌的主要风险因素，甚至认为高危型HPV持续感染是宫颈浸润癌发生发展必不可少的因素。但是到目前为止，HPV仍不能在组织细胞中培养，不易用血清学作流行病学调查，而且生殖道感染往往在血清学上没有表现，直接对生殖道上皮细胞HPVDNA的检测越来越引起人们的重视。HPVDNA检测不仅可以分辨严重病变患者，还可以分辨出潜在患者，使针对该病的高危妇女随访成为可能，因为从感染HPV发展为子宫颈癌需10余年时间，所以HPV细胞学阴性妇女可以减少就诊率。

持续的HPV感染能够将宫颈癌风险提高250倍，宫颈HPV高负荷量导致病毒不断复制，高危HPV基因可整合进宿主细胞染色体，患者很可能出现细胞学形态的异常。HPV可反复感染，亦可不同亚型同时感染，而其中HPV 16和18 型感染率最高，即HPV16占所有型别的50%，其病理类型主要为子宫颈癌鳞状上皮细胞癌；HPV18占14%，在子宫颈腺上皮细胞癌占主要地位；HPV 45 占8 % ；HPV31占5 %；其他型别占23 %[4]。HPV DNA检测是直接针对病因的检查，能够将已经患CIN或宫颈癌的妇女以及存在潜在发病风险的妇女筛选出来，可提高宫颈癌及癌前病变筛查的敏感性，临床中已作为宫颈病变筛查的重要手段。

3 常用HPVDNA检测方法

主要有实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)法、基因芯片法、杂交捕获法(Hybrid CaptureII，HC-Ⅱ)、高危型HPVDNA(酶切信号放大法)(cervista Higll-riskHuman apiuoma virus，Cervista HR-HPV)检测方法、Cobas HPV检测。这几种方法作为临床宫颈癌筛查的手段各有优劣，对其进行综合性分析和比较，可为临床宫颈癌筛查方法选择提供借鉴和参考。

3.1 实时荧光聚合酶链反应法

此法是以PCR为基础加上荧光标记探针，将目的基因扩增后再以各种方法来检测高危型HPV[5]，由于在完全封闭的系统中运行，避免了扩增产物污染和交叉污染，且在扩增时结合了特异探针的杂交，进一步提高了实验的敏感性和特异性，而且可以实时荧光监测扩增过程，结果准确可靠，适用于临床的大面积筛查，这一技术手段的出现给HPV检测的各个方面提供了巨大的发展空间，因为它能在体外扩增特定的DNA 基因，PCR 为在复杂的背景下检测这些片段提供了十分有用的工具，特别是对病毒感染的检测[6]。

另外实时荧光PCR法可一次同时检测多种HPV不同亚型的DNA，弥补了传统电泳法检测的不足，荧光PCR法检测为阳性即可对HPV阳性感染进行确诊，无需另外添置杂交仪和基因芯片阅读仪，有利于在基层进行大规模群体筛查[7]。但应用此法工作量较大，引物及探针的有效性需要大量的验证及改良，且目前实时荧光PCR实验成本比较高，均限制了其在临床的广泛应用。

3.2 基因芯片法

基因芯片法是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸，或直接将大量DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，再与标记的样本杂交，通过对杂交信号的检测分析，得出样本的遗传信息(基因序列和表达信息)。目前国内的基因芯片法HPV检测试剂均采用PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术，可以同时扩增出23种HPV基因型的目标片段，包括18种高危型别(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4)和5种低危型别(HPV6、11、42、43、44)，然后再将扩增产物与探针杂交，进行定性检测，该方法可用于临床HPV感染的辅助诊断和科研工作，可将不同HPV型别感染与宫颈病变的关系研究的更深入，同时还可以指导HPV疫苗的研究及临床使用。不过基因芯片法信号点的强弱不能提供定量参考，检测结果只能对样本进行定性分析，例如若在PC位点以外膜条上各检测位点有信号，说明感染了相应基因型的HPV，包括单一感染和混合感染。因为基因芯片法较实时荧光PCR的步骤多了杂交显色，所以总体上操作步骤相对繁琐，并且由于PCR扩增后，还需要开盖进行杂交实验，增加了实验室PCR产物污染的风险，有可能造成实验结果的假阳性，因此在实验室条件和操作水平能够完全保证的前提下，基因芯片法不失为一种很好的HPVDNA检测和分型方法。

3.3 杂交捕获法

目前临床大量应用的高危型HPV第二代杂交捕获试验检测技术(HC-Ⅱ)是经过了大规模临床试验，并通过美国药品食品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration，FDA)、欧洲统一安全认证(Conformite Europeenne certification)、中国国家食品药品监督管理总局认证(China Food and Drug Administration，CFDA)的HPVDNA检验方法。其检测原理是将送检标本放入DCMTM样本收集液中，利用RNA抗体捕获并应用微孔板化学发光对抗体捕获的信号加以放大的核酸杂交检测方法，无需基因扩增。它采用96孔平板法，可同时检测世界卫生组织(World Health Organization，WHO)确认的13种与宫颈癌相关的高危型HPV DNA的类型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)，并可同时检测样本中HPV DNA的病毒载量，但是不能精确分辨HPV类型。主要用于30岁以上妇女宫颈癌的初筛。

HC-ⅡHPVDNA检测技术采用半自动检测方式，杂交温浴洗涤光采集仪操作分步进行，针对宫颈癌及癌前病变的灵敏度和特异度均较高，在临床应用中具有99.9%的阴性预测值，假阴性减少，降低了漏诊率，可延长宫颈癌筛查间隔，并可及时发现细胞学涂片未见异常而高危型HPV持续阳性的妇女，此类人群短时间内发展为CIN 或浸润癌的风险极高[7]；临床判定具有统一标准(1.0ng/L，即为阳性)，减少假阳性，降低了误诊率；对不典型鳞状细胞ASCUS妇女分流管理时HCⅡ-HPVDNA检测阳性者立即行阴道镜检查，阴性者重复细胞学检查，把潜在患宫颈癌风险妇女从低风险妇女中分离出来，可合理指导阴道镜的使用；若对宫颈病变术后进行追踪与管理，术后6～12个月复查HCⅡ-HPVDNA，若结果仍为阳性，提示有残留病灶或复发可能；在对CIN转归的预测中，若CIN不伴高危型HPV感染，预示良性转归。

但是随着近年来国内外的广泛应用，也逐渐暴露出一些临床上的缺点和问题，如易产生交叉污染，成本费用较高，高危型与低危型存在一定的交叉反应，并且国外已有报道存在个别的高危型漏检，且因其灵敏度较高，尚不能有效区分一过性HPV感染和CIN 。HPV检测技术的不断发展和进步不但对HPV相关疾病的研究起了巨大推动作用，也为临床上开展HPV相关的检测服务提供了一系列可靠的方法和手段[8-10]。

3.4 高危型人乳头状瘤病毒DNA(酶切信号放大法)检测方法

此法于2009年经美国FDA批准用于临床，通过CervistaDNA的提取、检测信息录入、HPV-HR检测和荧光阅读仪读数进行结果分析判断，可同时检查14种高危型HPVDNA，具有较高的特异性和敏感性，Cervista HR-HPV检测方法与基因测序的检测方法具有较高的一致性，筛查宫颈病变阴性预测值较高，尤其对于CINⅡ+的检测，灵敏度与阴性预测值均较高，可以在正常人群或者对30岁以上女性进行HPV DNA检测[11]。

3.5 Cobas HPV检测

Cobas 4800HPV检测于2011年获得美国FDA认证，是一种通过PCR扩增检测高危型HPVDNA的体外定量检测技术，同目前国际认可的HC-Ⅱ检测均具有较高的准确性和灵敏度，不过由于Cobas 4800HPV增加了高危型的检测，具有更广的HPV基因型检测范围，并可特异性鉴别两种风险度最高的HPV16和HPV18及其他12种高危HPV型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)，提高了筛查的针对性，优先筛查出高危患者，能够及早发现高危病变，更有效地指导患者进一步检查或治疗，目前已成为宫颈癌的临床常用初筛方法[12]。

20世纪50年代以来，多种宫颈癌筛查方法的问世使得宫颈癌的发病率和病死率得到了有效控制，基因芯片法可以对患者所感染的HPV类型进行具体的分型，也可以同时检测高危型和低危型HPV病毒 ，因此可以通过一次性实验检测获得相对较多的检验信息，为临床提供更多的诊断依据和参考价值；HC-ⅡHPVDNA技术与荧光定量PCR方法相比，方法更简单，便于操作；不存在实验交叉反应，避免了假阳性结果，可靠性强；也不存在酶抑制反应，避免了假阴性；实验过程中无病毒复制，生物安全性好，因此HC2Ⅱ-HPV-DNA方法优于荧光定量PCR方法，结果更可靠[13-14]。

Cobas4800HPV检测和HC-Ⅱ检测均可有效判断HPV16型和18型这两种主要HPV感染类型[15]，但Cobas4800HPV检测可对13种HPV高危基因型进行检测，较HC-Ⅱ具有更广泛的筛查范围，因而更易筛选出受少见HPV基因型感染的患者[16-18]，并且HC-Ⅱ检测对一过性HPV感染和病变风险尚低的HPV感染患者筛查特异性不足，无法有效指导病变进展至CIN 患者的筛选，需要行进一步检测，操作繁琐[19]；而Cobas4800HPV检测具有良好的重复性，多次检测一致率较高，使得检测次数减少，控制了操作成本，且能够对是否行阴道镜下活检提供有效信息。同样有研究发现，相对于不能够对13种高危型HPV再进行细分检测的HCⅡ检测法，Cervista HR-HPV检测方法对于阴性人群的筛选具有更高的价值，能够更有效地指导患者进一步检查或治疗，值得广泛推广应用于宫颈癌的早期筛查。

随着科技的不断进步，临床用于HPV检测的产品也必将不断发展，目前宫颈癌已成为第一个可能通过疫苗接种和筛查进行综合预防的恶性肿瘤，相信随着各方学者的不懈努力和HPV筛查的不断普及，必将会让更多的女性远离宫颈肿瘤的威胁。

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[专业责任编辑：安瑞芳]

Research and development on different HPV DNA detection methods in diagnosis of cervical tumor

WANG Ping1,2, JIA Xiao-wen2

(1.SecondClinicalMedicalCollegeofShaanxiUniversityofChineseMedicine,ShaanxiXianyang712046,China;2.XidianGroupHospital,ShaanxiXi’an710077,China)

Human papilloma virus (HPV) infection is the main pathogenic factor of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and cervical cancer, and pathogenic ability is different due to different HPV types. But the persistent infection of high-risk HPV type is the most important factor of carcinogenesis of cervical cancer. In recent years, along with the development and improvement of cervical cancer census techniques, more and more early cervical cancer can be discovered in time partially due to the development of HPV DNA detection technology. This paper made comparative analysis of several commonly used methods, such as Real-time PCR, gene chip, Hybrid Capture Ⅱ, Cervista HR-HPV and Cobas HPV DNA detection for better service for the clinics.

human papilloma virus (HPV)；cervical intraepithelial neoplasia (CIN)；cervical cancer；DNA detection

2015-01-05

王 萍(1989-)，女，在读硕士研究生，主要从事妇产科临床工作。

贾小文，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.06.076

R711.7

A

1673-5293(2015)06-1329-03