慢病毒介导Nrp1过表达促进卵巢癌细胞增殖

张 燕，滕 月，张 键，李 婧，李 旭

(西安交通大学第一附属医院转化医学中心，陕西 西安 710061)

慢病毒介导Nrp1过表达促进卵巢癌细胞增殖

张 燕，滕 月，张 键，李 婧，李 旭

(西安交通大学第一附属医院转化医学中心，陕西 西安 710061)

目的 研究神经纤毛蛋白1 (neuropilin 1，Nrp1)在卵巢癌中的作用，探讨其作为治疗靶点的可行性。方法 克隆Nrp1基因，采用慢病毒包装体系包装过表达Nrp1的重组慢病毒，感染卵巢癌SKOV3细胞，嘌呤霉素筛选稳定高表达Nrp1的SKOV3细胞，通过细胞计数检测其增殖能力的改变。结果 成功包装了过表达Nrp1重组慢病毒，筛选得到了稳定高表达Nrp1的SKOV3细胞，其增殖能力显著高于对照细胞(t>t0.05(4)，P<0.05)。结论 Nrp1促进卵巢癌SKOV3细胞增殖，可能在卵巢癌发生发展过程中起促进作用。

卵巢癌；神经纤毛蛋白1；慢病毒；细胞增殖

卵巢癌是女性生殖器官最常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于宫颈癌和宫体癌，居于第3位[1]。由于其发病隐匿，缺乏有效的早期诊断方法，70%以上的患者初诊时已属晚期，治疗及预后效果极差，致死率居各类妇科恶性肿瘤首位[2]。因此，探寻卵巢癌发生发展过程中的关键分子，对于开发卵巢癌靶向治疗药物具有非常重要的意义[3]。神经纤毛蛋白1 (neuropilin 1，Nrp1)是一种单次跨膜糖蛋白，是神经轴突蛋白3家族(semaphorins 3，Sema3s) 和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)家族的共同受体[4]。Nrp1胞内段无功能结构域，不具备激酶活性，与配体结合后需再与神经丛蛋白Plexins或血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)结合形成三体复合物，介导活化信号向下游传递[5]。Nrp1可与多个配体相互作用，发挥多种功能，涉及神经调节、免疫调节、肿瘤发生[6]。目前已有多个研究小组报道了Nrp1在非小细胞肺癌[7]、乳腺癌[8]、肝癌[9]、胰腺癌[10]、结肠癌[11]、前列腺癌[12]等肿瘤中的重要作用，但未见Nrp1在卵巢癌中作用的相关报道。本研究拟包装过表达Nrp1的慢病毒，利用其感染卵巢癌细胞，建立稳定高表达Nrp1的卵巢癌细胞系，检测Nrp1过表达后卵巢癌细胞增殖能力的改变。本研究为进一步研究Nrp1在卵巢癌中的重要作用提供了实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

卵巢癌细胞系SKOV3为本实验室保存；Trizol购自于美国Invitrogen公司；RNA反转录试剂、高保真Taq酶、pMD18-T载体购自于日本TaKaRa公司；多聚酶链反应(polymerase chain peaction PCR)扩增引物购自于上海生工生物工程公司；兔抗Nrp1抗体购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

SKOV3细胞使用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，培养条件为37℃、5% CO2，每隔2天传代1次。

1.2.2 组织总RNA提取

取小鼠脑组织0.1g，加Trizol 1mL，冰中匀浆后转移至1.5mL离心管中。4℃下12 000rpm离心15min，转移上清加入200μL氯仿进行萃取，转移上层无色水相层加500μL异丙醇，沉淀用75%乙醇洗涤，晾干后溶于30μL DEPC水中。

1.2.3 RNA反转录

取总RNA 1μg加入oligo(dT)152μL，70℃温育10min。25μL反应体系中加5×buffer 5μL、10mM dNTP 2.5μL、AMV 1μL，42℃下孵育1h。95℃ 5min终止反应。

1.2.4 PCR分段扩增神经纤毛蛋白1

200μL反应体系中加cDNA模板2μL、10mM dNTP 0.5μL、10mM上下游引物各0.5μL、10 Buffer 2μL、高保真Taq酶2U。引物序列见表1。扩增产物回收后溶于30μL TE中，进行补“A”反应。

1.2.5 连接T载体

补“A”产物回收后与pMD18-T载体连接，连接体系为10μL，16℃反应过夜，次日转化大肠杆菌DH5α。挑选克隆，对于Nrp1上段(U)、中段(M)、下段(D)分别进行HindⅢ/SalI、SalI/XbaI、XbaI/EcoRI酶切，鉴定目的片段是否插入pMD18-T载体中。将阳性克隆送上海生工测序，序列正确的阳性克隆分别命名为U-pMD18-T、M-pMD18-T、D-pMD18-T。

1.2.6 亚克隆

用SspI/XbaI将M-pMD18-T中的Nrp1中段切下来，连接入同样酶切过的U-pMD18-T，构建成为U/M-pMD18-T。将PvuII/EcoRI将D-pMD18-T中的Nrp1下段切下来，连接入同样酶切过的U/M-pMD18-T，构建成为Nrp1-pMD18-T，PCR及测序鉴定。将Nrp1序列亚克隆至病毒骨架载体，酶切鉴定。

1.2.7 包装病毒

将3×105个HEK293FT细胞种于10cm平皿中，细胞密度达到80%时，将9μg pRRLsin-Nrp1、9μg p△R与3μg VSVG质粒共同转染入细胞中，12h后换新鲜培养基。24h后收集细胞培养上清，用0.45μm的滤膜过滤，此即为制备好的重组慢病毒。

1.2.8 感染SKOV3细胞建立稳定细胞系

将病毒原液加入50%～60%密度的SKOV3细胞，48h后将培养液更新为含5μg/mL嘌呤霉素新鲜培养基，荧光显微镜下观察绿色荧光，检测感染效率。每隔2天换液一次，直至单克隆产生。挑取单克隆，鉴定后进行扩大培养。

1.2.9 蛋白表达验证

细胞经PBS漂洗后加入预冷的细胞裂解液，用细胞刮刀将细胞刮下来，冰浴30min让细胞充分裂解，离心后取上清。BCA法定量后进行SDS-PAGE，结束后将胶从电泳槽取出，与NC膜一起放在转移缓冲液浸泡10min，按顺序将滤纸、胶、NC膜放入转移夹子中安装入槽，转移3h后取出NC膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1h，用适当比例Nrp一抗或GAPDH一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后用适当比例二抗室温孵育1h，洗膜3次后化学发光。

1.2.10 测定细胞增殖能力

将对照细胞和1#克隆细胞分别种入96孔板中，每孔5×103个，设5个复孔。每隔24h消化细胞，用Countess细胞计数仪计数，连续计数5天。

表1 Nrp1基因分段PCR扩增引物序列

Table 1 PCR amplication primer sequences for Nrp1 gene

2 结果

2.1 PCR分段扩增神经纤毛蛋白1上段、中段、下段3个片段

Nrp1基因全长2 772bp，长度过长，难于一次性扩增出来。我们采取分段PCR的策略，在Nrp1基因内部找出限制性酶切位点SspI和PvuII，将Nrp1分为3段，上段(U)大小为1 055bp、中段(D)大小为712bp、下段(D)为1 007bp，分别进行PCR。结果如图1所示，PCR增出的条带大小与预期的一致,见图1。

注：1：为上段引物扩增产物；2：为中段引物扩增产物；3：为下段引物扩增产物。

图1 PCR分段扩增Nrp1基因

Fig.1 PCR amplication of Nrp1 gene

2.2 构建神经纤毛蛋白1重组骨架载体

分别将3个片段连接至T载体，并分别采用HindⅢ/SalI、SalI/XbaI、XbaI/EcoRI双酶切进行鉴定。与预期一致，切出了大小约为1 000、700和1 000bp的条带，见图2，采取1号克隆进行测序分析，其条带确定为U、M和D。

依次将M、D切下连接至U-pMD18-T，构建为Nrp1-pMD18-T，PCR鉴定结果如图3所示，利用U上游引物/D下游引物可扩增出阳性条带，且条带大小在2 000bp以上。经测序，所得序列确定为Nrp1基因序列，且3段之间无间隔或插入序列。最后将Nrp1切下连接至病毒骨架载体，HindIII/EcoRI酶切鉴定结果如图3所示，1号克隆片段大小与预期一致，为阳性克隆。

图2 酶切鉴定重组pMD-18T载体

Fig.2 Restriction enzyme identification of recombinant pMD-18T

注：A为HindⅢ/SalI酶切鉴定重组载体U-pMD-18T,1～5为不同克隆；B为SalI/XbaI酶切鉴定重组载体M-pMD-18T，1～5为不同克隆；C为XbaI/EcoRI酶切鉴定载体D-pMD-18T，1～4为不同克隆。

2.3 稳定过表达神经纤毛蛋白1慢病毒的包装

共转染病毒包装质粒至293FT细胞中，24h后如图4所示，几乎所有细胞都表达绿色荧光蛋白，预计病毒包装情况良好。收集含病毒的培养上清，感染SKOV3细胞，48h后约30%细胞为阳性，该阳性细胞为成功感染Nrp1过表达慢病毒的SKOV3细胞。嘌呤霉素压力筛选21天后单克隆形成，扩大培养2个单克隆，经RT-PCR鉴定，该克隆的Nrp1 mRNA水平明显高于对照细胞。Western实验用抗Nrp1的抗体检测出了特异性条带，相对分子质量约为120kD，见图5，以上结果证明，筛选得到的2个稳定克隆的Nrp1的表达水平均高于对照细胞。

注：A为RT-PCR鉴定重组Nrp1-pMD-18T载体；B为HindⅢ/EcoRI酶切鉴定Nrp1重组骨架载体，1～3为不同克隆

图3 Nrp1重组骨架载体的构建

Fig.3 Construction of Nrp1 recombinant skeleton vector

2.4 细胞增殖能力检测

再采用细胞计数方法检测过表达Nrp1对卵巢癌细胞SKOV3细胞增殖能力的影响。实验结果表明，两组细胞在第3天起细胞数目产生显著差异(t>t0.05(4)，P<0.05)，稳定过表达Nrp1的SKOV3细胞与对照细胞相比，细胞数目为对照细胞的2倍，且差异一直持续到第5天，表明稳定过表达Nrp1导致细胞增殖能力变强，见图6。

注：A为共转染293FT细胞24h后明视野；B为共转染293FT细胞24h后GFP阳性细胞；C为感染SKOV3细胞48h后明视野；D为感染SKOV3细胞48h后GFP阳性细胞 。

图4 Nrp1过表达慢病毒的包装

Fig.4 Package of lentivirus overexpressing Nrp1

注：A为mRNA水平；B为蛋白水平。

图5 稳定高表达Nrp1细胞克隆的鉴定

Fig.5 Identification of stable overexpressing Nrp1 cell clones

图6 过表达Nrp1细胞与对照细胞增殖能力比较

Fig.6 Comparison of proliferation between overexpressing Nrp1 cells and control cells

3 讨论

3.1 神经纤毛蛋白1的研究现状

Nrp1是一种多功能受体。作为plexin的共受体，参与神经细胞导向和轴突生长的调控[4]；作为VEGFR的共受体，参与调控内皮细胞活化、增殖和迁移[6]；近期研究发现，Nrp1介导独立的信号通路，参与多种肿瘤的发生与发展[5]。由于其分布特点和多配体结合模式，Nrp1在肿瘤中的作用机制非常复杂。Nrp1既分布于肿瘤血管内皮细胞上，也直接分布于肿瘤细胞上，在这两个部位分别发生作用。Nrp1的两种配体Sema家族和VEGF家族呈拮抗作用[6]，导致Nrp1在不同情况下发挥不同的功能。Chu等[13]发现Nrp1通过激活NFκB促进上皮-间质转化，与人口腔鳞癌较差的预后相关。Chaudhary等[14]发现Sema3F通过与乳腺癌细胞表面Nrp1结合，抑制E-钙粘蛋白(E-cadherin)介导的乳腺癌细胞与基质的粘附，减少乳腺癌细胞播散。

3.2 慢病毒介导的基因过表达载体系统相比其他载体系统的优越性

慢病毒是一种高效的转基因病毒载体，感染靶细胞后不会感染其他细胞，也不会在宿主细胞内部产生新的病毒颗粒。与腺病毒和逆转录病毒等其他病毒载体相比，具备很多优点：如能够整合于宿主基因组中稳定长时间表达；能够感染非分裂细胞；组织嗜性广泛；感染后不表达病毒蛋白，细胞毒性小，宿主细胞免疫反应小等。慢病毒载体以其优越的基因转导能力现已成为研究者最为常用的基因修饰工具。

目前有多个研究都报道了Nrp1在多种肿瘤中的表达和作用，但Nrp1在卵巢中的作用尚不明确。本研究采用慢病毒包装系统，包装能够过表达Nrp1的重组慢病毒，通过慢病毒感染，建立稳定高表达Nrp1的SKOV3卵巢癌细胞系，比较过表达Nrp1后细胞增殖能力的差异。本研究初步证明Nrp1可以促进SKOV3卵巢癌细胞的增殖，初步揭示了Nrp1促进卵巢癌发生发展的作用，为进一步明确Nrp1在卵巢癌中的作用提供了实验基础。

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[专业责任编辑：张忠明]

Lentivirus-mediated Nrp1 overexpression promotes the proliferation of ovarian cancer cells

ZHANG Yan，TENG Yue,ZHANG Jian, LI Jing,LI Xu

(CenterforTranslationalMedicine,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To study the function of neuropilin 1 (Nrp1) in ovarian cancer and the possibility of Nrp1 as therapeutic target. Methods Nrp 1 gene was cloned, and Nrp 1 overexpressing recombinant lentivirus was packed. After infection of SKOV3 ovarian cancer cells, puromycin selection generated the stable cell clones overexpressing Nrp 1. Cell number counting assay was performed to detect the cell proliferation. Results Nrp 1 overexpressing recombinant lentivirus was successfully packed. The stable SKOV3 cell clones overexpressing Nrp 1 was selected, and it had more powerful proliferation ability than control cells (t>t0.05(4),P<0.05).Conclusion Nrp1 promotes the proliferation of SKOV3 cells, and may stimulate the progression of ovarian cancer.

ovarian cancer; neuropilin 1(Nrp1); lentivirus; cell proliferation

2015-06-18

张 燕(1981-)，女，助理研究员，医学博士，主要从事卵巢癌分子机制研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.04.017

R349.82

A

1673-5293(2015)04-0706-04

李 旭，教授。

[作者简介]滕 月(1983-)，女，助理研究员，医学博士，主要从事卵巢癌分子机制研究(共同第一作者)。