Notch1蛋白在儿童急性白血病中的表达及意义

赵晓莉，钱新宏，潘凯丽，李迎侠，王英娟

(1.陕西省第四人民医院儿科，陕西 西安 710043；2.第四军医大学西京医院儿科，陕西 西安 710032)

Notch1蛋白在儿童急性白血病中的表达及意义

赵晓莉1，钱新宏2，潘凯丽2，李迎侠2，王英娟2

(1.陕西省第四人民医院儿科，陕西 西安 710043；2.第四军医大学西京医院儿科，陕西 西安 710032)

目的 探讨儿童急性白血病(AL)骨髓细胞中Notch1蛋白表达及其与免疫分型的关系。方法 收集2009年10月至2011年11月初诊的42例AL患儿和22例正常或非恶性血液病儿童(对照组)骨髓涂片，采用免疫组织化学方法检测骨髓中Notch1蛋白表达情况。结果 42例AL患儿中，急性淋巴细胞白血病(ALL)32例，其急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)25例，急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)7例；急性髓细胞白血病(AML)10例。Notch1蛋白在儿童急性白血病中的表达情况，AML组表达率为60.0%(6/10)，T-ALL组为71.4%(5/7)，B-ALL组为28.0%(7/25)，对照组为13.6%(3/22)。与对照组相比，AML组和T-ALL组Notch1蛋白表达率均明显增高，差异均有统计学意义(χ2值分别为7.311、8.878，均P<0.05)；B-ALL组Notch1蛋白表达率亦高于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。T-ALL患儿和B-ALL组比较，差异有统计学意义(χ2=4.400，P<0.05)。Notch1蛋白阳性细胞表达率按照ALL-LR、ALL-MR、ALL-HR依次升高，HR组高于LR组及MR组，但组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 Notch1蛋白在不同类型的儿童AL中表达有明显差异，T-ALL发病与异常的Notchl信号有关。Notch1信号可能在AL中起着重要作用，但需要进一步收集资料论证。

急性白血病；Notch1蛋白；免疫细胞化学；儿童

急性白血病(acute leukemia，AL)是儿童时期最常见的恶性肿瘤，起源于造血系统的恶性增生，是儿童的主要死亡原因之一。近年来，儿童急性白血病患儿数呈显著提高，虽然经合理的规范化化疗，目前急性淋巴细胞白血病(ALL)的治愈率已达到80%左右[1]，但仍然有很多患儿对化疗反应不佳。研究显示，急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)的发生与Notch1蛋白(Notch1)密切相关[2]。目前对Notch1在乳腺癌、食管癌等实体瘤及成人各型白血病特别是T-ALL中的作用研究较多，Notch1在儿童AL中的报道甚少。成人作为成熟期的个体，各种类型白血病的研究结果是否与处于生长发育期的儿童相一致？因此采用免疫细胞化学技术检测AL患儿骨髓液中的Notch1蛋白表达，期待能对儿童白血病的靶向治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象

实验组(42例)为西京医院儿科2009年10月至2011年11月收治的患儿，全部符合2006年参考文献[2-3]的儿童急性白血病诊断标准。42例初诊的AL儿童中，ALL 32例，急性髓细胞白血病(AML)10例。ALL组中，男22例，女10例；LR 10例，MR 14例，HR 8例；T-ALL 7例，急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)25例；年龄2～14岁，中位年龄4岁。AML组中，男6例，女4例；AML-M2 5例，AML-M3 3例，AML-M5 2例；年龄2.6～10岁，中位年龄5岁。42例患儿中有40例接受治疗，2例放弃治疗。接受治疗的患儿均按标准进行系统规范化治疗[3-4]。

对照组为西京医院同期收治的22例确诊后为非恶性血液病儿童，其中血小板减少性紫癜16例，再生障碍性贫血4例，其他2例。其中男12例，女10例；年龄1～14岁，中位年龄6.5岁。

所有儿童的骨髓样本采集均征得患儿家长或/和患儿本人同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫分型及融合基因检测

所有AL患儿在初发时采集骨髓液1～1.5mL使用流式细胞仪进行免疫分型，根据白血病细胞表面抗原表达类别分为T-ALL、B-ALL、AML；采集骨髓液3mL进行BCR/ABL融合基因及染色体(9，22)异位的检测，所有AL患儿BCR/ABL融合基因及染色体(9，22)异位的检测呈阴性。

1.2.2 试剂

兔抗人Notch1多克隆抗体，购自美国Santa Cruz公司。免疫组化染色试剂盒(HistostainTM-Plus Kits)，浓缩型二氨基联苯胺(diaminobenzidin，DAB)试剂盒(ZLI-9032)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫分型标本来源于AL患儿初诊时的骨髓细胞，免疫分型用单克隆抗体购自BD公司。

1.2.3 实验步骤

质量控制：阴性对照：以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，其余所加试剂及步骤一致。

1.2.3.1标本采集 用干净的载玻片将实验组和对照组儿童骨髓液约0.3mL推平在防脱载玻片上，骨髓涂片要厚薄均匀，头、体、尾分明，室温下放置40min，自然晾干，每1份标本涂片2张，一张用于滴加Notch1抗体，另一张用于做阴性对照。把骨髓涂片置37℃孵育箱24h，有助于待检细胞贴壁。用4%多聚甲醛室温孵育固定30min，常温下自然干燥后，-20℃冰箱保存备检。

1.2.3.2 Notch1蛋白检测 取出-20℃冰箱保存的骨髓涂片，室温放置15min。用0.2%TritonX-100，透化2～5min。PBS冲洗3次，每次3min(每次冲洗时用滴管轻柔操作，避免备检细胞脱片)。加1滴3%H2O2去离子水孵育10min(孵育均在湿盒内)，以消除内源性过氧化物酶的活性。用PBS冲洗3次，每次3min。滴加试剂A(封闭用山羊血清)，室温孵10min。倒掉或者吸干液体。每张玻片上加1:200稀释的一抗或者PBS液，4℃冰箱过夜。用PBS冲洗3次，每次3min。每张玻片上滴加试剂B(生物素标记山羊抗兔IgG)，室温孵育15min。PBS冲洗3次，每次3min。每张玻片上加1滴试剂C(辣根酶标记链霉卵白素工作液，S-A/HRP)，室温孵育15min。PBS洗涤3次，每次3min。每张玻片上加一滴新鲜配制的DAB显色液，常温避光显色2～15min，在显微镜下观察显色情况。1×PBS冲洗玻片，终止显色。苏木素复染衬染胞核：苏木素染色液染色5～10min，根据染色结果调整时间。PBS冲洗终止显色，晾干。脱水，透明，中性树胶封片：95%乙醇脱水2min；换用新鲜95%乙醇再脱水2min；二甲苯透明5min；换用新鲜二甲苯，再透明5min；用中性树胶封片。显微镜下观察、拍照，计数Notch1受体蛋白阳性细胞的百分率，具体见统计分析。

1.2.4 结果判断

显微镜下，Notch1蛋白表达阳性细胞，细胞膜/细胞浆/细胞核内出现棕黄色或棕褐色物质，主要定位于细胞浆与细胞膜，阳性细胞散在分布；阴性对照，细胞的细胞浆及细胞核全部呈蓝色。每例高倍镜视野下随机计数100个白血病细胞，按照参考文献的方法稍作改动，从细胞着色强度及阳性细胞占同类细胞总数的百分比进行综合评分[5]：细胞无着色计0分，棕黄色计1分，棕褐色计2分；Notch1蛋白阳性细胞数<5%为0分，Notch1蛋白阳性细胞数5%～10%为1分， 10～30%为2分，>30%为3分，两项结果总分>2分为阳性，<2分为阴性。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0中文版统计软件包进行统计处理，数据用百分率表示，率的比较采用χ2检验及Fisher确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 急性白血病儿童Notch1蛋白的表达

Notch1蛋白在儿童急性白血病中的表达情况：AML组表达率为60.0%(6/10)，T-ALL组为71.4%(5/7)，B-ALL组为28.0%(7/25)，对照组为13.6%(3/22)，见图1。AML组与对照组相比，差异有统计学意义(χ2=7.311，P<0.05)，T-ALL组与对照组相比，差异有统计学意义(χ2=8.878，P<0.05)，B-ALL与对照组相比差异无统计学意义(χ2=1.481，P>0.05)，ALL组与对照组相比，差异无统计学意义(χ2=3.700，P>0.05)。T-ALL与B-ALL患儿相比较，差异有统计学意义(χ2=4.400，P<0.05)。Notch1受体蛋白阳性细胞的显微镜下显示见图2。

图1 Notch蛋白在AL各组和对照组表达率比

Fig. 1 Notch protein expression rate in AL groups and the control group

B-ALL细胞阳性表达 T-ALL细胞阳性表达

AML细胞阳性表达 对照组

注：图中箭头指向为阳性细胞，免疫组化SP法，×400。

图2 Notch1蛋白在AL儿童与对照组骨髓细胞中的表达

Fig. 2 Notch1 protein expression in bone marrow cells of AL children

and the control group

2.2 Notch1蛋白与急性淋巴细胞白血病临床危险度分型的关系

32例ALL患儿中，Notch1蛋白阳性细胞表达率按照ALL-LR、ALL-MR、ALL-HR依次升高，HR组高于LR组及MR组，但组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 Notch1蛋白在ALL各型的表达[n(%)]

Table 1 Notch1 protein expressions in each types of ALL [n(%)]

3 讨论

3.1 关于Notch基因

Notch基因最早发现于果蝇，是在进化上高度保守的一个信号传导系统，其功能部分缺失会在果蝇的翅缘造成切迹，Notch基因调控着从果蝇到人类几乎所有组织、器官细胞的增殖、分化与凋亡。人类共有4个Notch受体(Notch1～Notch4)和5种Notch配体(Delta-like1、3、4，Jagged1和Jagged2)。目前国内外学者对Notch1基因的研究成果颇多[6-8]。相邻两个细胞Notch1受体与配体结合后，Notch1信号通路立即激活，经过3步蛋白水解过程，从细胞膜上释放其胞内活性成分ICN1(Notch1)，ICN1最终定位于细胞核内，参与转录激活复合体的形成，经过一系列中间过程最终激活下游靶基因Hes-1等的转录，对细胞分化的起始过程进行简单却精准的调控。

3.2 Notch1蛋白在儿童急性白血病中的意义

Notch基因与恶性肿瘤的关系最早在人类T-ALL中被发现。在T-ALL中，存在Notch信号的普遍活化，Notch基因的高表达，T细胞恶性肿瘤几乎都有Notch信号通路的活化[9]。近年来的研究结果显示，ICN1增多和T-ALL的发生有很大关系，将ICN1植入小鼠体内，能100%诱发小鼠T-ALL[10]。目前Notch信号途径阻断剂GSI已用于T-ALL的临床治疗，研究指出，在T-ALL的移植模型上进行持续GSI治疗以后能产生有效的抗白血病反应，而且能获得较好的耐受[11]。尽管GSI会造成胃肠道毒性，但其能逆转T-ALL的糖皮质激素抵抗，如果将GSI和糖皮质激素联合应用能够减轻其胃肠道毒性[12]，这也提示，针对Notch信号途径的治疗能为T-ALL的治疗提供新的治疗思路。Notch1作为治疗肿瘤的新靶点，在现代肿瘤研究领域中具有十分重要的临床意义。本实验中，采用免疫细胞化学方法对42例儿童急性白血病进行研究，发现Notch1在儿童不同类型AL中的表达有明显差异，T-ALL发病与异常的Notchl信号有关。与正常对照相比，在AML患儿中，Notch1蛋白阳性率增高，差异具有统计学意义，但ALL差异没有统计学意义，而ALL和AML比较，差异同样无统计学意义，因此，Notch1信号可能在AL中起着重要作用。前期研究曾经应用RT-PCR方法对32例ALL患儿mRNA表达阳性率进行半定量分析，发现Notch1在T-ALL中明显高表达，而在B-ALL中表达水平较低[13]，这与本实验结论相一致。

王冠玲等[5]应用免疫组化的方法对11例AML患儿研究发现，Notch1受体蛋白阳性表达率较高，表明Notch1在粒系来源的髓性白血病中可能起着重要作用。本研究采用免疫细胞化学方法检测10例AML儿童骨髓细胞中的Notch1蛋白，得出同样结论。然而，事实是否真如此，尚需扩大样本量进一步探讨。

Notch信号与B淋巴细胞恶性疾病也关系密切。霍奇金病的恶性B细胞中检测到Notch1受体的高表达，Notch1受体活化后与配体相结合，信号通路被激活，促进B细胞生长转化，抑制了亚砷酸引起的细胞凋亡。也有研究指出，Notch高表达可以抑制p53介导的细胞凋亡，若阻断Notch信号后，p53表达升高并启动细胞凋亡程序以促使肿瘤消退[14]。本研究结果显示，与对照组相比，在B-ALL患儿中，Notch1蛋白阳性率虽有增高，但差异并没有统计学意义，考虑是否与样本数较少有关。

另外，本研究对32例ALL患儿Notch1蛋白阳性细胞表达率进行检测，发现阳性率按照ALL-LR、ALL-MR、ALL-HR水平依次升高，尽管组间比较无统计学差异，但是否该检测与ALL的临床危险度分型存在关联，还需要收集数据进一步研究。

在儿童急性白血病中，存在着Notch1信号的活化。其在儿童不同类型急性白血病中的表达有明显差异，在急性淋巴细胞白血病T-ALL患儿中的Notch1表达高于B-ALL；在儿童急性髓细胞白血病中Notch1也呈异常表达，Notch1在儿童AML的发病中可能也起着一定的作用。

[1]桂永浩主编.小儿内科学高级教程[M].北京:人民军医出版社,2014:328.

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[专业责任编辑：潘凯丽]

Expression of Notch1 protein in children with acute leukemia and its significance

ZHAO Xiao-li1, QIAN Xin-hong2, PAN Kai-li2, LI Ying-xia2, WANG Ying-juan2

(1.DepartmentofPediatrics,FourthPeople’sHospitalofShaanxi,ShaanxiXi’an710043,China;2.DepartmentofPediatrics,XijingHospitalFourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China)

Objective To study the expression of Notch1 protein in children with acute leukemia (AL) and to explore the relationship of Notch1 expression with immunophenotype. Methods The bone marrow smears of 42 cases of AL and 22 healthy children or cases of nonmalignant hematologic disease were collected during October 2009 to November 2011. Immunocytochemical assay was used to detect the expression of Notch1 protein in the cases. Results Of 42 cases of AL, there were 32 cases of acute lymphocytic leukemia (ALL) including 25 cases of B-ALL and 7 cases of T-ALL, and 10 cases of acute myelogenous leukemia (AML). The expression rate of Notch1 protein was 60.0%(6/10), 71.4%(5/7), 28.0%(7/25)and 13.6%(3/22)in AML group, T-ALL group, B-ALL group and the control group, respectively. Compared with the control group, the expression rate of Notch1 protein in AML group and T-ALL group was remarkably increased, and the differences were significant (χ2value was 7.311 and 8.878, respectively, bothP<0.05). The expression rate of Notch1 protein was higher in B-ALL group than in the control group, but the difference was not significant (P>0.05). The difference in the expression of Notch1 protein between T-ALL group and B-ALL group was not significant (χ2=4.400,P<0.05). The expression rate of Notch1 protein positive cells increased gradually in ALL-LR group, ALL-MR group and ALL-HR group, and that was higher in HR group than in LR group and MR group. But the comparison between groups showed no significant difference (P>0.05). Conclusion There are significant differences in the Notch1 protein among children with different types of AL, and abnormal expression of Notch1 is correlated with the occurrence of T-ALL. Notch1 signals might play important role in AL, which needs further researches to confirm.

acute leukemia (AL); Notch1 protein; immunocytochemistry; children

2015-04-26

赵晓莉(1970-)，女，硕士研究生，主要从事儿童血液、消化疾病的诊疗工作。

潘凯丽，主任医师/教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.04.006

R725.5

A

1673-5293(2015)04-0672-04