分子印迹技术在农兽药残留检测中的应用

文│何丛薇 王姣姣 赵春娟 高文惠（河北科技大学生物科学与工程学院）

分子印迹技术在农兽药残留检测中的应用

文│何丛薇 王姣姣 赵春娟 高文惠（河北科技大学生物科学与工程学院）

一、引言

分子印迹技术（MIT）是指把某一个特定的目标分子作为模板分子，制备对该目标分子具有特异选择性聚合物的过程，通常被定义为制备与识别“分子钥匙”的“人工锁”的技术。MIT是将要被分离的目标分子作为模板分子，通过交联剂和引发剂的作用，在聚合物的单体溶液中聚合得到单体-模板分子复合物，然后除去模板分子，便得到“印迹”了目标分子的空间孔穴的分子印迹聚合物（MIPs），聚合物中就留下了空间大小、形状及功能基团与印迹分子匹配的“记忆”，这样的空穴对模板分子具有选择性。MIT起源于20世纪40年代，直到1993年Vlatakis等在Nature上发表了有关茶碱分子印迹聚合物的报道后，才因为它的通用性和立体专一识别性的特点，引起了许多科研工作者的兴趣。分子印迹聚合物具有选择性较高、耐受能力强、稳定性较好、使用寿命长、应用范围广等众多特点，越来越受到人们的青睐。

近年来，分子印迹技术已广泛应用到环境保护、药物研发、生物技术及食品安全等领域，并显示出广阔的前景。随着人们健康意识的增强，对于食品和饲料中农兽药的残留问题日益关注。目前国内外对食品和饲料中农兽药残留限量的要求越来越低，因此我们需要寻找选择性好、灵敏度高、操作简单快速、成本低且高效可靠的检测技术来适应农兽药残留检测技术的发展，由于分子印迹技术的特点顺应了农药兽药残留检测技术的发展趋势，因此在农药兽药残留检测领域有很广阔的应用前景。

二、分子印迹技术的应用

1.MIT在色谱分离中的应用。MIT在色谱分离技术中的应用最重要的是将MIPs用于色谱固定相。其应用涉及高效液相色谱（HPLC）、薄层色谱（TLC）、毛细管电色谱（C E C）和超临界流体色谱（SFC）。

高效液相色谱具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高和分析范围宽等优点而广泛用于生化、食品分析和药物分析等领域。李莉等在2007年以磺胺甲噁唑为模板分子，利用原位聚合法制备了具有特定识别性能的棒状分子烙印聚合物。将它作为高效液相色谱的固定相实现了磺胺甲噁唑与其结构类似物的分离。磺胺甲噁唑烙印聚合物与目标分子间的相互作用除了有特异性的氢键作用外，还存在着疏水作用。本试验还考察了含水量和流速对其分离的影响，同时论证了分子烙印聚合物选择性专一的作用原理。结果表明，这种棒状分子烙印聚合物对模板分子及其类似物有很好的分离能力。

薄层色谱是用于化合物快速分离和微量物质半定量分析的一种实用技术，具有操作简单、分析快速和应用广泛等优点。R.Suedee等利用薄层色谱，制备了伪麻黄碱与去甲麻黄碱的分子印迹聚合物作为手性固定相，并用制备的手性固定相对肾上腺素类药物（伪麻黄碱，麻黄素，去甲麻黄碱和肾上腺素）的对映体的分辨率进行了研究。在分子印迹聚合物的制备中，甲基丙烯酸和衣康酸作为功能单体，甲醇或乙腈作为流动相，并且研究了流动相中乙酸含量的影响。基于用衣康酸作为功能单体的去甲麻黄碱的分子印迹聚合物，用含有1%乙酸的甲醇流动相，去甲麻黄碱的手性分离获得最好的分辨率。这些MIPs能够分析对应于印迹分子化合物的外消旋体的结构。结果表明，基于这种MIPs的薄层色谱能作为一种分离方法成功分离肾上腺素类药物的对映体。该方法为光学活性化合物的质量控制提供了一种快速、灵敏和可靠的方法。

2.MIT在固相萃取中的应用。固相萃取技术具有操作简单、价格便宜、吸附容量大、易与检测仪器联用等优点，而基于分子印迹聚合物作为吸附剂的分子印迹-固相萃取（MISPE）是一种比传统固相萃取技术更高效和高特异性的技术。采用分子印迹聚合物作为固相萃取技术的填料，其识别能力可以在识别目标物的同时，除去大部分干扰，方便仪器分析，因此成为农兽药分析的重要手段。

杨磊以四环素作为模板分子，丙酮-十二醇-聚乙二醇作为溶剂，α-甲基丙烯酸（MAA）作为功能单体，用乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯（TMPTA）作为交联剂，最终制备了分子印迹有机整体柱，并将它作预柱使用，对奶粉样品中的四环素类抗生素进行了净化与富集。在优化的在线固相萃取条件下，净化、富集效果很好，对盐酸土霉素、四环素，美他环素的加标回收率均大于84.2%，富集倍数分别为18.9、19.3、17.8，检出限分别为9.25、8.48、11.74克/千克，定量限为30.8、28.3、39.1克/千克。该试验实现了分子印迹有机整体柱作为预柱使用来与高效液相色谱联用测定奶粉样品中痕量四环素类抗生素的残留。

刘博等建立了分子印迹固相萃取-高效液相色谱法检测饲料中联苯三唑醇。采用本体聚合法自制联苯三唑醇分子印迹聚合物，并以此聚合物为固相萃取剂，对饲料样品中联苯三唑醇进行了分离富集。利用高效液相色谱法测定其在饲料中的残留情况。结果表明：该方法线性范围为1～200微克/毫升，检测限为0.5微克/毫升，平均回收率为76.4%～89.0%。

高文惠等利用虚拟模板分子印迹固相萃取技术对食品中的联苯三唑醇与烯唑醇进行了分离富集，并建立高效液相色谱检测方法。以腈菌唑为模板分子，丙烯酰胺为功能单体，EDMA为交联剂，乙腈为致孔剂，采用本体聚合法制备得到了腈菌唑分子印迹聚合物，以此聚合物为固相萃取剂，制备固相萃取柱，对食品中联苯三唑醇和烯唑醇进行分离富集，并采用高效液相色谱法测定其在食品中的残留。采用C18色谱柱分离，以甲醇-水（体积比为90∶10）溶液为流动相，紫外检测波长为210纳米，外标法定量。结果表明，联苯三唑醇和烯唑醇的平均回收率分别为89.40%～90.88%和81.37%～83.26%，相对标准偏差（RSD）分别为1.08%～2.04%和1.29%～2.52%，检测限均为0.20微克/克。此聚合物对两种杀菌剂具有良好的吸附能力，拟模板分子印迹固相萃取技术可以用于这两种杀菌剂的分离检测。

胡静等建立了分子印迹固相萃取-高效液相色谱法检测食品中两种三唑类杀菌剂残留的方法。分别以三唑醇、烯唑醇为模板分子，MAA为功能单体，EDMA为交联剂，采用本体聚合法合成分子印迹聚合物。将制得的三唑醇、烯唑醇聚合物按质量比1∶1混合，制成固相萃取柱用于样品的前处理，并采用高效液相色谱法检测。结果：在低和高浓度添加水平下，平均回收率在78.7%～94.3%之间，RSD在1.8%～2.4%之间（n＝5）。结论：该方法灵敏度高，精密度好，适合于同时检测食品中三唑醇和烯唑醇两种三唑类杀菌剂残留。

魏艳玲等建立了基于分子印迹固相萃取-高效液相色谱同时测定鸡血浆中环丙氨嗪和三聚氰胺的残留方法，实现了用离子对反相高效液相色谱紫外同时分析检测，环丙氨嗪和三聚氰胺在0.10～10.0微克/毫升范围内线性关系良好，鸡血浆中三聚氰胺和环丙氨嗪的回收率均高于70%，RSD＜10%，检出限达0.05微克/毫升，为血浆等复杂基质中二者的同时测定提供了一种高选择性、高效和灵敏的分析方法。

肖琴等将分子印迹固相萃取和高效液相色谱法联用，建立了一种检测鱼肉中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物残留的新方法。该方法对鱼肉样品的回收率为97.06%～111.83%，RSD为1.54%～10.49%。他建立的新方法简单快速、准确可行，而且有机溶剂用量少，被成功地用于鱼肉中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物残留的测定。

3.MIT在膜分离中的应用。分子印迹膜将膜分离的可连续化操作与MIPs的高选择性相结合，合成的具有分子识别功能的薄膜将是功能材料研究领域中一个重要的发展方向。目前制备的分子印迹膜主要有3种：分子印迹填充膜、分子印迹整体膜和分子印迹复合膜。

Zhu等在尼龙膜表面将甲基丙烯酸作为功能单体，甲苯作为致孔剂合成了对杀虫剂久效磷具有选择性吸附的分子印迹复合膜，结果表明该印迹复合膜对久效磷具有较高的选择性。L.Donato等采用光聚合法把聚丙烯平板膜作为基膜，S-蔡普生作为模板分子，4-乙烯吡啶作为功能单体，制备了S-萘普生分子印迹复合膜。试验结果表明该复合膜对S-萘普生的选择性吸附因子为1.6。

王靖宇采用热聚合方法和原子转移自由基聚合方法以萘普生和茶碱作模板分子和聚偏氟乙烯平板膜或中空纤维膜为基膜，制备了分子印迹膜。聚合后在聚偏氟乙烯基膜表面形成了一层印迹膜。用高效液相色谱系统测试分子印迹膜的分离效果，结果表明外消旋的萘普生通过分子印迹柱后的色谱图中出现两个峰，分别对应于S-萘普生和R-萘普生，该分子印迹体系的分离机理为促进渗透机理。

Kochkodan等在聚偏氟乙烯膜表面涂敷一层敌草净印迹聚合物薄层制备了分子印迹复合膜，将其用于水溶液中敌草净的选择性分离。该膜对敌草净具有很高的特异吸附性，水通量可达4.59升/（平方米·小时）。在对影响膜表面修饰度及膜性能的因素研究中发现，膜的修饰度预涂敷过程中膜表面引发剂的浓度和聚合时间对其有影响，聚合时间越长，修饰度越高，膜表面沉积层厚度增加，膜孔径变小，印迹位点增多，表观吸附量增大。

张春静等选用多孔的醋酸纤维膜为支撑层，首先将其浸入含奎宁模板分子的氯仿溶液中30分钟，然后在4℃氮气氛围中于360纳米紫外灯光下聚合48小时得到分子印迹膜，该复合膜保持了醋酸纤维膜良好的通量，奎宁在该膜上结合量达到20.6微摩尔/克。试验结果表明，多孔醋酸纤维膜具有较好的耐有机溶剂性和耐紫外光照性能，能够使分子印迹膜获得较大的渗透量。

4.MIT在传感器中的应用。传感器是由信号转换器和识别元件两部分构成，识别元件以某种方式位于转换器的表面，当所检测的目标分子与识别元件结合时，就会产生一个物理或化学信号，这时转换器就会将此信号转换成一个可定量的输出信号，通过监测输出的信号对目标分子进行实时测定。将分子印迹聚合物作为识别元件，结合不同种类转换器而制得的分子印迹传感器既具有生物传感器的专一识别性，又有化学传感器的机械稳定性、热稳定性，因而成为传感器领域研究的新热点。自1987年Tabushi首次用分子印迹聚合物作为敏感材料，对维生素进行检测之后，人们就对分子印迹聚合物传感器产生兴趣。分子印迹传感器的应用包括光学传感器、电化学传感器等。

张挪威采用光聚合法在一次性丝网印刷电极上制备琥珀酸氯霉素分子印迹膜，其后将丝网印刷电极通过电极插口与电化学分析装置相连接，组装成检测琥珀酸氯霉素残留的电化学传感器，利用与传感装置相连接的记录仪记录响应的结果。本传感器建立了检测氯霉素的标准曲线并测试了实际牛奶样品中氯霉素含量的方法。电镜观察表明，与非印迹膜相比，在印迹膜表面形成大量直径约为100纳米的印迹微孔。本传感器装置检测琥珀酸氯霉素具有很高的灵敏度和特异性，检出限为2×10-9摩尔/升，检测线性范围为1×10-8～1.2×10-5摩尔/升，基于牛奶样品的检测回收率介于93.5%～95.5%之间。

马永飞制备了一种对莠去津有识别特性的分子印迹膜，即在含和不含模板分子的情况下，利用循环伏安技术在金电极表面沉积2-巯基苯并咪唑，制备了2-巯基苯并咪唑聚合膜。利用循环伏安法对印迹和非印迹膜行为进行了评价，对分子印迹膜的影响因素进行了筛选和优化。试验表明，该分子印迹膜对莠去津具有良好的选择性和灵敏度。莠去津的还原峰电流与浓度在1.2×10-8～8.0×10-5摩尔/升范围内具有良好的线性关系（r＝0.99862），检出限可达3.0×10-9摩尔/升。此传感器测定土壤中的莠去津，回收率在90.8%～98.2%之间，取得了很好的效果。

连惠婷等基于壳聚糖功能基体的电化学沉积，将久效磷作为模板分子，在玻碳电极表面直接制备具有记忆功能的分子印迹电化学传感器。借助以氢键为主的弱的分子间作用力，实现久效磷在壳聚糖聚合基体内的印迹，而施加＋0.6V电压改变复合物成键的微环境可以实现洗脱。对分子印迹膜性质、洗脱方式等制备条件进行考察，其后采用阳离子型电化学探针三氯化六铵合钌，研究分子印迹传感器对久效磷的电化学响应特性。结果表明，所制备的久效磷分子印迹电化学传感器具有较高的选择性，对久效磷的检测限可达0.1微摩尔/升。

刘镇通过沉淀聚合法制备了兽药氯霉素的分子印迹聚合物，并构建了分子印迹压电生物传感器，通过对检测条件的优化，该传感器对氯霉素具有良好的响应，且具有良好的特异性识别能力，成功应用于虾肉和猪肝脏中氯霉素的残留检测，用该方法检测虾肉和猪肝脏中的氯霉素具有前处理简单，设备便宜，响应时间短等优点，该方法有望在以后得到实际应用。

廉文静等通过分子印迹技术、结合壳聚糖-碳纳米管复合物和纳米金构建快速检测卡那霉素的分子印迹传感器。用电聚合法将分子印迹聚合物聚合到金电极上，采用循环伏安法和安培法经电化学工作站检测传感器的电流响应。结果表明：该传感器的检测线性范围为3×10-8～4×10-5摩尔/升（r＝0.988），最低检测限为1.29×10-8摩尔/升（信噪比为3）。重复试验的相对标准偏差为3.6%。结果证实该分子印迹传感器具有很强的灵敏度、特异选择性、重复性和稳定性，并在实际样品检测中显示了很好的回收率（95%～102%）。

目前，印迹传感器技术可用于莠去津、敌草净、2，4-D、草甘膦、对硫磷、氯霉素等农药的检测，对大部分农药检测限可达微摩尔/升级。随着分子印迹技术和微电子技术的发展，分子印迹传感器技术将作为一种新的农药检测方法，具有广阔的发展前景。

三、展望

MIT比传统分离净化方法具有很多优势，但目前仍存在一些问题。结合位点的作用机理、传质机理仍不清楚，需开展大量工作从分子水平上更好地理解分子识别过程；目前合成MIPs需使用大量模板分子，难以从根本上解决模板分子渗漏现象，限制了MIT在痕量分析中的实际应用，采用替代模板聚合法是解决此问题的有效方法；现今多数MIPs中识别位点与模板分子之间的分子间作用力以氢键为主。当用于生物、环境样品等水相体系的前处理时，其识别过程会受到水等强极性溶剂干扰，在水溶液或极性溶剂中进行分子印迹和识别仍是难题。

河北省科技支撑计划项目（10276902D），石家庄市科技支撑计划项目（12149472A）