PTEN启动子甲基化及基因表达与宫颈癌临床指标的关联研究

郝烁月

(辽宁省辽阳市中心医院妇产科，辽宁 辽阳 111000)

PTEN启动子甲基化及基因表达与宫颈癌临床指标的关联研究

郝烁月

(辽宁省辽阳市中心医院妇产科，辽宁 辽阳 111000)

目的 探讨PTEN启动子甲基化及基因表达与宫颈癌临床指标的相关性。方法 选取2013年1月至2014年1月期间辽阳市中心医院收治的100例宫颈癌患者作为研究对象，分别采用PCR-SSCP、甲基化特异性PCR及免疫组化技术检测组织PTEN启动子甲基化及基因表达情况，并分析其与患者临床病理资料的相关性，PTEN启动子甲基化及基因表达相关性。结果 100例宫颈癌患者中PTEN启动子甲基化阳性例数为62例，PTEN启动子甲基化率为62.0%。PTEN基因表达阳性例数50例，阳性率为50.0%。PCR-SSCP分析发现1例患者出现新的突变，位于第9个外显子。PTEN启动子甲基化与宫颈癌患者FIGO分期、肿瘤分级、肿瘤大小以及淋巴结转移均有显著相关性(χ2值分别为4.802、8.440、7.472、8.237，均P<0.05)，与宫颈癌患者年龄以及组织分型均无显著相关性(χ2值分别为0.075、0.180，均P>0.05)。PTEN基因表达与宫颈癌患者FIGO分期以及淋巴结转移有显著相关性(χ2值分别为2.597、7.250，均P<0.05)，与宫颈癌患者年龄、肿瘤分级、肿瘤大小以及组织分型均无显著相关性(χ2值分别为0.041、2.627、2.716、0.219，均P>0.05)。宫颈癌组织中PTEN启动子甲基化及其基因表达呈显著负相关(r=-0.65，P=0.014)。结论 PTEN启动子甲基化可以抑制PTEN基因的转录，降低其蛋白表达，PTEN蛋白表达降低可能参与宫颈癌发生、浸润和转移。

PTEN基因；启动子甲基化；基因表达；宫颈癌

PTEN基因位于人第10号染色体，是具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，其编码产物PTEN蛋白具有调节细胞生长周期、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长及侵袭转移等作用。相关研究发现PTEN在多种肿瘤组织中表达下调，但其发生机制尚不完全清楚[1]。为了探讨PTEN启动子甲基化及基因表达对宫颈癌患者的影响，本文对辽阳市中心医院2013年1月至2014年1月期间收治的100例宫颈癌患者进行研究，现将内容报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2013年1月至2014年1月期间辽宁省辽阳市中心医院妇产科收治的100例行手术切除的宫颈癌患者作为研究对象，所有患者经病理学诊断确诊为宫颈癌，均未接受辅助放化疗。年龄范围38～78岁，平均年龄60.3±8.3岁。本研究经本院伦理委员会讨论通过，所有患者均签署知情同意书。肿瘤的组织学类型和分类参照世界卫生组织制定的肿瘤进行分类标准，肿瘤组织的临床分期参照国际妇产科联合会(international federation of gynecology and obstetrics，FIGO)制定的标准[2]。

1.2 方法

1.2.1 宫颈癌组织DNA提取

将制作好肿瘤组织石蜡块切成10μm大小，并于液氮的条件下研磨粉碎，取0.1g粉碎的组织悬浮于1mL 0.25%的二甲苯溶液中，55℃条件下静置15min，取悬浮液离心5min，取沉淀悬浮于0.1mL二甲苯溶液中，重复上述步骤，弃去上清。使用100%乙醇和二甲苯裂解缓冲液溶解沉淀，并加入浓度为300μg/mL的蛋白酶K裂解液，充分混匀后55℃过夜，采用酚-氯仿法提取DNA，并溶于TE缓冲液，储存于-20℃条件下保存备用。

1.2.2 PTEN启动子甲基化分析

分别设计PTEN启动子区9个外显子的引物，采用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction- single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)技术和甲基化特异性PCR(methylation-specific polymerase chain reaction MS-PCR)检测技术检测，以试剂盒提供的通用甲基化DNA标准作为阳性对照，水和未修饰的DNA用作反应阴性对照，重复PCR已确认结果。PTEN启动子未甲基化引物：5'-TTTTTTGGGTTTTTGAAATTTAATG-3'，5'-AACCTACTATTATA￣TCACCAACATA-3'PTEN启动子甲基化引物：5'-GTTTTTT￣GGGTTTTTGAAATTTAAC-3'，5'-AACCTACTATTAT￣ATCGCCA￣ACGTA-3'。

1.2.3 PTEN基因表达检测

采用免疫组化技术检测PTEN基因表达情况，免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物公司，严格按照说明及免疫组化操作步骤操作。PTEN阳性标本的宫颈炎患者的切片作为阳性对照，无第1抗体的切片作为阴性对照。染色结果判定为阴性或者阳性，肿瘤细胞≥10%呈阳性免疫反应性的切片判定为阳性，肿瘤细胞<10%呈阳性免疫反应性的切片判定为阳性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。宫颈癌患者病理资料与PTEN启动子甲基化以及基因表达等相关性的计数资料率的比较采用χ2检验。采用经非参数Spearman等级相关分析PTEN启动子甲基化及其基因表达相关性，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌患者PTEN启动子外显子甲基化、基因表达及突变情况分析

在100例宫颈癌患者中，PTEN启动子甲基化阳性例数为62例，PTEN启动子甲基化率为62.0%。PTEN基因表达阳性例数50例，阳性率为50.0%。PCR-SSCP分析发现1例患者出现新的突变，位于第9个外显子。

2.2 宫颈癌患者病理资料与PTEN启动子甲基化相关分析

PTEN启动子甲基化与宫颈癌患者FIGO分期、肿瘤分级、肿瘤大小以及淋巴结转移均有显著相关性(χ2值分别为4.802、8.440、7.472、8.237，均P<0.05)，与宫颈癌患者年龄以及组织分型均无显著相关性(χ2值分别为0.075、0.180，均P>0.05)，见表1。

2.3 宫颈癌患者病理资料与PTEN基因表达相关分析

PTEN基因表达与宫颈癌患者FIGO分期以及淋巴结转移均有显著相关性(χ2值分别为2.597、7.250，均P<0.05)，与宫颈癌患者年龄、肿瘤分级、肿瘤大小以及组织分型均无显著相关性(χ2值分别为0.041、2.627、2.716、0.219，均P>0.05)，见表2。

表1 宫颈癌患者病理资料与PTEN启动子甲基化相关分析(n)

表2 宫颈癌患者病理资料与PTEN基因表达相关分析(n)

2.4 宫颈癌患者PTEN启动子甲基化及其基因表达相关性

经非参数Spearman等级相关分析，在宫颈癌组织中PTEN启动子甲基化及其基因表达呈显著负相关(r=-0.65，P=0.014)，见表3。

表3 宫颈癌患者PTEN启动子甲基化及其基因表达相关性(n)

3 讨论

3.1 PTEN基因表达与肿瘤的发生

宫颈癌是第2大常见女性恶性肿瘤，每年约有78万女性患者死于宫颈癌，其发生发展过程与原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关。已经发现PTEN基因表达在癌症细胞系以及脑、胃原发性肿瘤、乳腺癌和肾癌等肿瘤组织缺失。在胃癌，非小细胞肺癌和子宫颈癌中发现PTEN基因启动子出现甲基化现象[3-4]，而在肿瘤组织中PTEN启动子突变、甲基化和基因的表达相关性尚未有相关报道。

3.2 宫颈癌中PTEN突变

研究表明PTEN突变和缺失在相关癌组织中较为普遍，在子宫内膜癌发生率约为40%，在胶质母细胞瘤发生率约为25%，在卵巢癌发生率约为21%，在前列腺癌发生率约为13%[5]。但是在宫颈癌组织中的突变率似乎较低。本研究结果发现，100例宫颈癌患者仅有1例患者出现突变，而在外国人群中调查数据显示宫颈癌组织中的PTEN突变率约为2%。

3.3 PTEN启动子甲基化及其基因表达与宫颈癌病理因素相关性

本研究结果显示，PTEN启动子甲基化与宫颈癌患者FIGO分期、肿瘤分级、肿瘤大小以及淋巴结转移有相关性(P<0.05)，且PTEN基因表达与宫颈癌患者FIGO分期以及淋巴结转移有相关性(P<0.05)，表明PTEN在宫颈癌发生、发展、浸润和转移过程中发生重要作用，而PTEN启动子甲基化及其基因表达缺失不利于宫颈癌患者的预后。有研究报道，PTEN缺失常发生在宫颈癌早期，与盆腔淋巴结转移密切相关[6]。本研究经非参数Spearman等级相关分析，在宫颈癌组织中PTEN启动子甲基化及其基因表达呈负相关(P=0.014)，提示PTEN的表达降低，可能是由于PTEN基因的启动子甲基化所致，PTEN基因启动子甲基化是一种重要的基因沉默机制。而相关研究也认为DNA甲基化能够抑制转录和微小RNA介导的mRNA降解，导致翻译终止，从而导致PTEN表达减少[7]。

综上所述，PTEN启动子甲基化可以抑制PTEN基因的转录，降低其蛋白表达，PTEN蛋白表达降低可能参与宫颈癌发生、浸润和转移，PTEN的表达可能是宫颈癌预后的一个好的标志。

[1]Xie Q, Bai Q, Zou L Y,etal. Genistein inhibits DNA methylation and increases expression of tumor suppressor genes in human breast cancer cells[J].Genes Chromosomes Cancer，2014,53(5):422-431.

[2]杨晨曦,王宁,张婷,等.宫颈癌细胞系及宫颈组织PTEN基因启动子区甲基化状态的检测与分析[J].现代妇产科进展,2014,23(2):89-93.

[3]Woelber L,Kress K, Kersten J F,etal.Carbonic anhydrase IX in tumor tissue and sera of patients with primary cervical cancer[J].BMC Cancer.2011,11:12.

[4]Rizvi M M,Alam M S,Ali A,etal.Aberrant promoter methylation and inactivation of PTEN gene in cervical carcinoma from Indian population[J].J Cancer Res Clin Oncol,2011,137(8):1255-1262.

[5]Stiles B L.Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10:Extending its PTEN tacles[J].Int J Biochem Cell Biol,2009,41(4):757-761.

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[专业责任编辑：安瑞芳]

Correlation of PTEN promoter methylation and gene expression with clinical indicators in cervical cancer

HAO Shuo-yue

(DepartmentofObstetricsandGynecology,CenterHospitalofLiaoyangCity,LiaoningLiaoyang111000,China)

Objective To investigate the correlation of PTEN promoter methylation and gene expression with clinical indicators in cervical cancer. Methods From January 2013 to January 2014 totally 100 cases of cervical cancer admitted in Center Hospital of Liaoyang City were recruited in the study. Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP), methylation-specific polymerase chain reaction (MS-PCR) and immunohistochemical method were used to detect PTEN promoter methylation and gene expression, analyze their correlation with clinical pathological information as well as the correlation between PTEN promoter methylation and gene expression. Results The rate of PTEN promoter methylation of 100 cases was 62.0%, and the positive rate of PTEN gene expression was 50.0%. PCR-SSCP analysis found that one patient had a new mutation located on the ninth exons. PTEN promoter methylation were significantly correlated with FIGO stage, tumor grade, tumor size and lymph node metastasis (χ2value was 4.802, 8.440, 7.472 and 8.237, respectively, allP<0.05), but not significantly correlated with age and tissue typing (χ2value was 0.075 and 0.180, respectively, bothP>0.05). PTEN gene expression were significantly correlated with FIGO stage and lymph node metastasis (χ2value was 2.597 and 7.250, respectively, bothP<0.05), but not significantly correlated with age, tumor grade, tumor size and tissue typing (χ2value was 0.041, 2.627, 2.716 and 0.219, respectively, allP>0.05). PTEN promoter methylation in cancer tissue was negatively correlated with gene expression (r=-0.65,P=0.014). Conclusion PTEN promoter methylation can inhibit transcription of PTEN and reduce its protein. PTEN protein expression decreasing may induce the occurrence, invasion and metastasis of cervical cancer.

PTEN; promoter methylation; gene expression; cervical cancer

2014-11-18

郝烁月(1975-)，女，副主任医师，硕士，主要从事妇产科临床工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.01.041

R711.7

A

1673-5293(2015)01-0105-03