水貂沙门氏菌的分离鉴定与药敏试验

王海龙 秦国栋（山东省诸城市积沟畜牧兽医站 262200）张敏敏（山东农业大学 271000）

水貂沙门氏菌的分离鉴定与药敏试验

王海龙 秦国栋（山东省诸城市积沟畜牧兽医站 262200）张敏敏（山东农业大学 271000）

目前，规模化养貂场一般采用抗生素治疗水貂沙门氏菌病。但是由于抗生素的滥用以及不当的服用，导致细菌耐药性的产生，造成用药浪费，延误水貂病情，使养殖户遭受巨大的经济损失。本试验通过药物敏感性试验，为选用有效抗生素提供依据。

1 试验材料与仪器

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源

60只病死水貂样本均来源于诸城市大森林养殖基地。临床主要表现病初水貂不进食，情绪也不稳定，体温增加，一般为41～42℃，并伴有呼吸困难；部分水貂伴有呕吐和腹泻，或者轻微的黄疸症状。大部分水貂出现上述症状一段时间内就死亡。也有的水貂出现持续性腹泻，粪便带有血液；有的患貂出现化脓性结膜炎；咳嗽或呕吐。有的水貂发出痛苦的叫声，突然就昏迷抽搐，四肢做游泳状滑动。发病的水貂出现水肿症状。个别的貂没有症状突然死亡。尸体消瘦，可视膜苍白；肺脏萎缩、表面有黑色坏死斑，严重出血；心代偿性增大；肝脏轻微肿大，表面有针尖大小出血点；胃干瘪，粘膜脱落；肠系膜毛细血管充血；肠粘膜出血、脱落；脾脏轻微肿大，被膜紧张；肾脏稍微肿大，呈灰红黄色被膜下有点状出血。

1.1.2 培养基及试剂

显色培养基 （购自青岛海博生物公司； 批号：20130301）、胆盐硫乳琼脂培养基（DHL）（购自上海一基生物科技有限公司；批号：20130311）、沙门菌属志贺菌属琼脂 （SS）（购自北京九州天瑞科技有限公司； 批号：20130312）、三糖铁琼脂 (TSI）（购自上海科兴生物科技有限司；批号：20130115）、生化常规微量鉴定管（购自上海丽臣生物科技有限公司；批号：20130119）等。

1.1.3 药敏试验纸片

由诸城市畜牧兽医管理局实验室制作。

1.2 试验仪器

HT-SDC(SW-CJ-2F）超洁净工作台（济南昊天科技发展有限公司）、MLS-3780高压灭菌锅（杭州亚旭生物科技有限公司）、DHP-9602恒温培养（杭州汇尔仪器设备有限公司）、冰箱、常用玻璃器皿等。

2 试验方法

2.1 病原菌分离鉴定

2.1.1 各种培养基的制备

显色培养基、胆盐硫乳琼脂、三糖铁琼脂、按常规进行配制，无菌检查后，4℃保存备用[1]。

2.1.2 涂片及染色

取采集的肺脏、肝脏、脾脏和肾脏病料刮取物涂片，干燥，革兰氏染色。将抹片置于空气中自然干燥；火焰固定，将已干燥的抹片菌膜向上，在火焰上缓缓来回通过3次（用手背触及玻片反面，以不烫手为宜）。染色：①初染，在固定的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液染色1～2min，水洗。②媒染，再加革兰氏碘溶液于抺片上，助染1～2min，水洗。③脱色，用95%酒精滴于载玻片上脱色约30s。应将载玻片不时摇动，至无色素脱下为止，水洗。④复染，用沙黄染液复染1min，水洗。⑤吸干或自然干燥。镜检观察[2]。

2.1.3 分离培养与观察

取采集的肺脏、肝脏、脾脏和肾脏病料刮取物，接种于显色培养基、胆盐硫乳琼脂平板和SS营养琼脂平板，37℃培养24h，观察细菌生长情况及菌落特征；同时，将上述内脏组织样本匀浆后制成悬液，将组织悬液样本及上述血样本分别接种于普通琼脂平板37℃常规24h。待培养完毕后，再分离单独菌落得到纯培养物。挑选可疑的单菌落划线接种于营养琼脂培养基上，37℃恒温培养24h，观察细菌生长情况及菌落特征，然后单个菌落抹片，进行革兰氏染色、显微镜观察。从鉴别培养基上挑取2～3个疑似菌落接种于三糖铁琼脂斜面并刺穿至底层，在恒温培养箱培养18～24h，观察结果。

2.1.4 生化试验

用接种环从营养琼脂培养基中挑选出具有代表性的菌落与微量发酵管中，置37℃培养12h观察其生长情况。甲基红（MR试验）：用接种环从营养琼脂培养基中挑选出具有代表性的菌落，接种到葡萄糖蛋白胨培养管中培养36～48h，加入MR试剂5滴左右，观察其变化。靛基质试验：用接种环从营养琼脂培养基中挑选出具有代表性的菌落，接种到蛋白胨水培养基中培养24～48h，试管中加入靛基质数滴摇动试管，观察其变化情况。硫化氢产生试验：用接种环取少量培养物，接种到培养基中培养24～48h，观察其变化。V-P试验：取一支葡萄糖蛋白胨培养管先加V-P试剂甲液（6%的甲萘酚酒精溶液）3ml，再加V-P乙液（40%KOH溶液），充分摇匀静止数分钟，观察其变化情况。

2.2 药敏试验

采用纸片扩散法进行药敏试验，将细菌均匀涂布在营养琼脂平板上，再将配制好的药敏片贴于平板上，放在37℃恒温箱中培养24h后，测量两个平板上的抑菌圈直径，取其平均值，结果判断判定标准：抑菌直径＜10mm为耐药；抑菌直径10～15mm为中度敏感；抑菌直径15～20mm为高敏；抑菌直径≥20mm为极敏。

3 试验结果及分析

3.1 涂片染色结果

革兰氏染色之后，在油镜下观察可见大量两端钝圆、短小的革兰氏阴性小杆菌，无芽孢，无荚膜。

3.2 分离培养结果

在显色培养基上呈紫色；而SS琼脂平板上呈圆形、微凸、边缘整齐小菌落，菌落为白色半透明；另外在DHL琼脂平板上呈圆形、微凸、边缘整齐黑色的小菌落。分离菌株在三糖铁琼脂斜面中产酸、斜面变红。

3.3 生化试验结果

该菌能分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇，不分解乳糖、蔗糖，靛基质试验呈阴性，MR试验阳性，V-P试验阴性，不分解尿素，能利用枸橼酸钠。

3.4 药敏试验结果

该沙门氏菌对环丙沙星、左旋氧氟沙星、克林霉素、头孢曲松钠为高敏，对万古霉素、硫酸粘菌素为中敏，对丁胺卡那霉素、氨苄西林、庆大霉素为低敏。

根据流行病学、病理剖检变化及实验室诊断，可判断该次疾病的流行是由沙门氏杆菌感染引起。根据药敏试验结果，用0.5%盐酸左旋氧氟沙星全群饮水治疗，不能饮水的病貂肌肉注射头孢曲松，经3天的治疗，病情得到有效的控制。

4 讨论

（1）根据水貂的临床症状、病理剖检、细菌的分离鉴定和生化试验、判定水貂患病死亡是由于感染了沙门氏菌引起。

（2）由黄世娟等[3]人研究的鸡沙门氏菌药敏试验分离菌对壮观霉素、卡那霉素、四环素高敏；对青霉素、利福平中敏；对环丙沙星、恩诺沙星、林可霉素低敏；对万古霉素、链霉素产生耐药。由刘俊伟等[4]人研究的猪霍乱沙门氏菌对18种抗菌药的敏感性试验猪霍乱沙门氏菌对左旋氧氟沙星、磷霉素钠、头孢噻呋敏感，对诺氟沙星和新霉素中敏，对头孢唑啉、头孢拉定、利福平、环丙沙星、卡那霉素、氨苄西林、庆大霉素、阿莫西林、恩诺沙星等耐药。在赵波等[5]的研究中，其所分离多株沙门氏菌均表现出不同耐药性，而其中羧苄西林的耐药率最高。而本次药敏试验结果与上述结果有一定的出入，这可能与不同养殖场用药习惯有关。

（3）通过多次对诸城大森林养殖基地调查研究，养殖场备有大量的丁胺卡那霉素、氨苄西林、庆大霉素。养殖场人员在水貂发病时，并没有做药物敏感试验而盲目的滥投药，致使本次试验中对丁胺卡那霉素、氨苄西林、庆大霉素低敏，正是因为养殖场用药习惯使沙门氏菌产生耐药的结果。

（4）通过多次试验采取对症治疗办法具有一定的辅助治疗作用，对体温过高的水貂直肠给药清瘟败毒散；对腹泻不止的可用乌梅散开水冲调，候温灌服；对水肿的病貂可将五苓散伴水饲喂具有较好的治疗效果。

[1]胡桂学.兽医微生物学实验教程[M].北京:中国农业大学出版社,2006（9）:22-28.

[2]黄世娟,陈进喜,彭定兵,等.鸡沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验[J].广西畜牧兽医,2011,27（4）:213-215.

[3]杨晓洁.梅花鹿单核细胞增生性李氏杆菌病的诊治[J].畜牧与兽医,2007,39（7）:48.

[4]俊伟,张海棠,张志鹏,等.规模化猪场猪霍乱沙门氏菌的分离鉴定与药敏试验[J].河南农业科学,2011,40（4）:146-148.

[5]赵波,李波,王强,等.灵长类动物肠道沙门氏菌的分离鉴定与药敏试验[J].中国畜牧兽医,2013,40（1）:164-167.

王海龙（1963-），男，兽医师，专科。

张敏敏（1989-），女，硕士研究生。