两种放散法检测新生儿溶血患儿红细胞致敏抗体的比较▲

黎海澜 焦 伟 莫柱宁 朱春丽 阳子骥

(广西壮族自治区人民医院输血科，南宁市 530021，E-mail:46549668@qq．com)

母婴血型不合新生儿溶血病(hemolytic disease of newborn，HDN)可导致新生儿黄疸、贫血、水肿、肝脾肿大，甚至胆红素脑病。因此，采用敏感而且准确的检测技术对HDN早期、准确的诊断有重要的意义［1－4］。直接抗球蛋白试验、抗体游离试验和抗体放散试验被称为检测HDN的“三项试验”，是早期检测HDN的经典方法。放散试验在三项中最为敏感，是确诊HDN的实验［5］。放散方法有多种，目前国内实验室多采用传统的热放散法或酸放散法。本研究分别用酸放散和热放散法检测HDN患儿红细胞致敏抗体，以评价两种方法在HDN实验室诊断中的应用效果。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 临床资料 选择2012年1月至2014年5月我院收治355例疑似HDN的患儿及其母亲血标本，其中男性患儿172例，女性患儿183例，年龄2 h至13 d，≤5 d 341例，＞5 d 14例，临床主要表现为贫血和黄疸。随机选取同期在本院住院的70例母婴血型相同或相合、直接抗球蛋白试验及抗体筛查阴性的高胆红素血症患儿血样本做研究对照，其中男34例，女36例;年龄9 h至11 d;合并新生儿窒息13例、母乳缺乏12例、感染9例、出生后体重明显下降5例、胎粪排出延迟7例、头颅血肿6例、低血糖2例、胎膜早破8例、宫内窘迫8例。

1．2 试剂 标准抗-A(B)血清、IgM 抗-D、E、C、c、e及抗人球蛋白试剂、筛选细胞、谱细胞等均来自上海血液生物医药有限责任公司。ABO标准红细胞为本实验室自制，酸放散试剂盒购自长春博迅生物技术有限公司，DiaMed低离子/抗人球蛋白卡、DiaMed专用离心机、DiaMed专用卡孵育系统等均由珠海保瑞达公司提供。其他仪器还有KA-2200型离心机(日本久保田研究所)，恒温水浴箱等。试剂均在有效期内使用。

1．3 方法 采母亲、HDN患儿静脉血(必要时脐带血)，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。母亲血样本用于血型鉴定及抗体检测。患儿血标本经3 400 r/min离心2 min，分离血浆及压积红细胞。压积红细胞用生理盐水充分洗涤3次，留取末次洗液作对照。取压积红细胞10 μl配成2%、1%红细胞盐水悬液备用。在2支试管中分别加入洗涤好的压积红细胞各1 ml，待同时做热放散、酸放散试验。

1．3．1 血型鉴定、血清抗体检测和实验方案:参照文献［6］，鉴定患儿及母亲ABO及Rh血型，根据母婴ABO血型相合与否，按以下程序检测:三项试验;母亲血清抗体检测等。

1．3．2 热放散法:依照文献［6］。在 1 体积(≥1 ml)的压积红细胞中加入等容量的生理盐水，混匀，置56℃水浴箱中孵育10 min，期间轻摇几次。取出后置预先准备盛有56℃热水的离心套管内，立刻以3 400 r/min离心2 min，取上清液(放散液)做相应检测。

1．3．3 酸放散法:严格依照厂商的试剂盒说明书进行酸放散。酸放散液配制:将放散液A与放散液B按体积比4∶1比例混合均匀(必须现配现用)。将1 ml洗涤好的待检压积红细胞与1 ml配制好的酸放散液混合均匀，室温孵育1 min后，以3 400 r/min离心1 min(勿超时)，取上清放散液与中和液按500μl∶80 μl比例混匀，再以3 400 r/min离心2 min，取出上清液(此上清液中含有从红细胞表面解离的抗体)做相应的检测。

1．3．4 检测放散液中 IgG抗-A(B)、抗-Rh抗体:用微柱凝胶法分别检测2种放散液中的抗-A(B)、抗-Rh抗体，选取98例检出抗体的放散液进行倍比稀释后加相应试剂红细胞，测定抗体效价并按凝集强度4+(12分)、3+(10分)、2+(8分)、1+(5分)、±(2分)、0(0分)计算评分［7］。在低离子/抗球蛋白卡中加入1%相应试剂红细胞各 50 μl后，各加上述放散液 50 μl，37℃孵育15 min，置卡式专用离心机离心10 min，按产品说明书判读结果。

1．4 母婴血型不合新生儿溶血病诊断标准［8］(1)母子血型不合;(2)抗体释放试验或直接抗球蛋白试验阳性;(3)发生高胆红素血症。

1．5 统计学分析 使用SPSS 13．0进行统计学处理。计量资料分布不符合正态性，故用中位数表达，采用秩和检验，计数资料用秩和检验，以P ＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 两组检测结果 355例疑似母婴血型不合HDN患儿中，确诊为 HDN 277例，其中 ABO-HDN 275例，Rh-HDN 2例。275例ABO-HDN患儿样本中，酸放散试验均检出与患儿血型抗原所对应的抗体，无假阳性。热放散试验检出的阳性病例，酸放散试验均检出阳性。其中有6例ABO-HDN患儿采用酸放散试验结果阳性(2+～4+)，而热放散试验结果阴性，但加入放散液量成倍增加(≥100 μl)时结果均阳性(±～1+)。随即取患儿用于其他检测的血样本，并确保用于热放散的压积红细胞≥1 ml，严格按文献操作规程重复试验，结果与原来一致。2例Rh-HDN患儿用酸放散法、热放散法检测均阳性。放散液的回收量和外观比较:等体积的致敏红细胞，酸放散法获得的放散液外观呈浅红色透明、清晰，量多于热放散法;热放散法所得放散液呈樱红色半透明。酸放散试验耗时约35 min，热放散试验则为45 min。

70例高胆红素血症患儿血样本(其中母婴均为O型30例、A型15例、B型15例，母亲为AB型10例)同时用酸放散法与热放散法进行抗体释放试验，结果均阴性。

2．2 两种检测方法检出的抗体效价及其评分比较 酸放散法放散液中IgG抗-A(B)、抗-Rh抗体效价及评分均高于热放散法(u=6．280，P＜0．001)。酸放散法与热放散法所得红细胞放散液中抗体评分分布差异有统计学意义(P＜0．05)。98例母婴血型不合HDN两种放散液中抗体效价及评分分布、热放散法与酸放散法对HDN患儿红细胞致敏抗体的放散效果比较，分别见表1、表2。

表1 98例母婴血型不合HDN两种放散液中抗体效价分布(n，%)

表2 98例HDN患儿热放散法与酸放散法放散液中抗体效价评分［中位数(四分位间距)］

3 讨论

本研究结果显示，酸放散法效果优于传统热放散法，酸放散法的抗体放出效率高于热放散法(P＜0．05)。酸放散法放散液中IgG抗-A(B)、抗-Rh抗体效价评分均高于热放散法(P＜0．05)，酸放散液抗体效价为4、8、16、32者比例明显高于热放散液。在受检的98例HDN患儿热放散液中，93例(94．9%)抗体效价≤4，5例(5．1%)抗体效价为8;而酸放散液中65例(66．3%)抗体效价≤4，20 例(20．4%)抗体效价为 8，11 例(11．2%)抗体效价为16，2例(2．0%)抗体效价为32。笔者在实验中选取部分标本做了热放散后充分洗涤3次，然后将其用酸放散法进行重复放散试验，仍可检出致敏的抗体。6例ABO-HDN患儿采用酸放散试验结果阳性，而热放散试验结果阴性，但加入放散液量成倍增加(≥100 μl)时出现弱阳性结果，说明对等体积致敏红细胞进行放散时，酸放散法所得放散液抗体浓度明显高于热放散法。据之推测:对受检标本量较少(如压积红细胞＜1 ml)的病例，用酸放散试验应比传统热放散试验更有优势。笔者发现热放散试验时，放散液要全部用于相应反应体系中(放散液应≥100 μl)，并及时检测，这不仅使抗体检测的方法学选择受到限制，而且实验室不在反应体系(如微柱凝胶法)中调整放散液的加入剂量，就有可能得到假阴性结果，会延误HDN患儿的诊治。这提示:对HDN的血清学检测，采用不同的红细胞致敏抗体放散方法及对放散液中抗体检测方法的正确选择影响着实验结果。

综上所述，对于HDN的实验室诊断，酸放散试验与传统热放散试验定性检测结果无差异，但酸放散试验放散效能较优，人为干扰因素少，耗时短，试验条件技术要求难度低，是一种更可靠、便捷的HDN诊断方法。

［1］ 戎 霞，罗广平，陈杨凯，等．ABO血型不合新生儿溶血病3种检测方法的比较［J］．中国输血杂志，2008，21(5):361－362．

［2］ 冯体玉，张惠琴．481例高胆红素血症新生儿溶血病血清学检测［J］．检验医学与临床，2014，11(1):77 －79．

［3］ 李保才，黎海澜．母婴血型不合引起新生儿溶血病的实验室诊断［J］．检验医学与临床，2011，8(23):2 886 －2 887．

［4］ 曾德理，石明芳．3种不同剂量放散液检测新生儿ABO溶血病的结果分析［J］．广西医学，2011，33(11):1 447－1 448．

［5］ 张勇萍，杨世明，苏小花，等．新生儿溶血病ABO血型免疫性抗体检测分析［J］．细胞与分子免疫学杂志，2010，26(11):1 154－1 155．

［6］ 叶应妩，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程［M］．第3版．南京:东南大学出社，2006:246－271．

［7］ 美国血库协会技术手册委员会编．输血技术手册［M］．肖星甫，季 阳，尚书颁，等．译．北京:人民卫生出版社，1985:280－281．

［8］ 王永午．实用儿科手册［M］．北京:人民军医出版社，1997:343．